犬血型系统研究进展

王 雪，姜忠玲，丛 霞，曹荣峰，田文儒，李华涛

(青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109)

与人类的血型一样，犬的血型是具有种属特异性和抗原性的红细胞表面的遗传标记，即犬红细胞表面抗原，实质多为糖蛋白。犬具有很多血型基因，每种血型基因独立遗传，相互之间互不影响，在同一犬的红细胞上可以同时出现多种血型的组合。由于犬的红细胞抗原种类繁多，血型分类比较复杂，因此犬血型的检测技术难度较大。血型鉴定关系到输血疗法的风险程度，目前国内缺乏用于犬血型鉴定的检测试剂[1]，而国外已有建立动物血库，并有成熟的犬血型检测技术，能及时对需输血的病犬进行输血治疗，大大降低输血风险。

1 犬血型概述

1900年人类ABO血型系统的发现刺激了家畜血型系统的研究[2]，Von Dungern和Hirszfeld根据免疫凝集反应在1910年首次定义了4个犬的血型。人们最初是以犬作为动物模型研究输血过程中产生的免疫反应。Swisher S N等[3]在1949年—1961年第一次系统研究了犬的血型，随后又报道6种犬的血型[4]。Bell在1983年对犬血型的发展历史、检测方法和遗传方面进行系统全面的阐述。在犬群中测得相应抗原的频率，他们研究血型系统的方法在1961年和1962年被世界公认。

犬血型系统第一次根据它们被发现的顺序分别被命名为A、B、C、D、E、F和G。其中A血型又被分为一个强反应型A和一个稍弱反应型A′，这种命名方法随后被转化为A1和A2[5]。由于抗E和抗G检测血清被丢失，因此后来缺少这两种血型的研究[6]。1972年到1974年世界研讨会召开，第一次把犬血型系统命名标准化，以犬红细胞抗原(canine erythrocyte antigen，CEA)，后面跟随相应的数字命名，分别命名为CEA(1，2...8)。为了与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)相区别，第二次把犬血型系统命名为犬红细胞抗原(dog erythrocyte antigen，DEA)，后面跟随相应的数字。现在美国通用的命名为DEA1.1、DEA1.2、DEA3、DEA4、DEA5、DEA6、DEA7和DEA8。有商品化可用检测血清的是DEA1.1、1.2、3、4、5和7。目前，仍有多种血型是未知的，有些血型系统已有报道，由于缺乏相应有效的检测血清，因而没有被公认，但它们在犬输血医学中有着非常重要的潜在价值，且每种血型都独立遗传，可以在红细胞表面共存。例如犬血型为DEA1.1，表明犬的红细胞表面表现出DEA1.1和DEA4抗原，但未表达出DEA3、DEA5和DEA7。当只测DEA1.1时，犬的血型可以被标识为DEA1.1阳性或者DEA1.1阴性。迄今为止，共描述了13种不同的犬血型系统[7]，犬的血型鉴定在很多实验室都是一个常规的服务项目，主要目的为了安全的输血治疗。

1.1 犬DEA1.1和DEA1.2系统

DEA1.1血型系统在美国、加拿大和澳大利亚分别被鉴定出来。这个血型系统由多个等位基因决定，其中包括DEA1.1、DEA1.2、DEA1.3和DEA1.1阴性。这4种血型仅可能在同一个犬的红细胞独立出现。研究表明，DEA1.1血型系统是由常染色显性基因决定[8]。因此，犬的DEA1.1血型系统可能表现4种基因型中的1种。DEA1.1血型系统是犬输血过程中最主要的溶血因素，DEA1.1抗体在体内和体外能引起强烈的凝集和溶血反应，其他的血型系统一般不会影响到不同个体之间血液的相容性。虽然通常情况下并不存在天然的DEA1.1同种抗体，初次输血不可能发生严重的不良输血反应，但是会使机体产生大量抗体，并使随后的输血造成严重的输血反应，伴发血红蛋白血症和高胆红素溶血症，并且在12 h内使输注的红细胞被清除[9]。常规输血治疗中，输注的血液通常在犬体内可以存活21 d，但发生急性溶血性输血反应时，不相容的输注的红细胞可能会在输血后几分钟到12 h完全发生溶血。因此，经初次免疫后，再次接触输血时，犬可能会在输血后的几天内产生大量的抗体，而引发严重的输血反应。犬大约有33%～45%的DEA1.1阳性率，这些DEA1.1阳性的犬可以被称之为万能受血犬，它们可以接受任何血型的犬提供的血液，而不会产生严重的输血反应。DEA1.1阴性犬的血液输入任何血型的犬，基本上不会产生危及生命的输血反应，因此，DEA1.1阴性的犬可以被认为是犬输血治疗中的普遍的供血犬。临床上，通常严重的输血反应现象会发生在接受输血的DEA1.1阴性犬，两次接受的血液均为DEA1.1阳性血液，产生的抗DEA1.1抗体有可能破坏献血者的红细胞，产生严重的输血反应，不仅没有达到输血治疗的目的，而且还会引起急性溶血性输血反应产生大量的血红蛋白，增加接受治疗的犬的肝脏代谢负担，进一步加大犬的病情。此外，这些同种抗体也会出现在母犬的乳汁中，对DEA1.1阴性犬是一个很不利的因素。因此，在医疗条件允许的情况下，具有DEA1.1阴性的犬尽量避免接受DEA1.1和DEA1.2阳性犬提供的血液。

研究表明，DEA1.1血型系统与犬的新生儿溶血症有关。DEA1.1阴性母犬和DEA1.1阳性公犬交配有可能会产生DEA1.1阳性的新生犬。如果母犬已经交配过一次或者之前有过输血经历，他就有可能会因为之前受DEA1.1刺激产生的抗DEA1.1抗体通过初乳转移给新生犬。新生犬在出生后可在3 d～10 d内出现溶血性贫血症[10]。

1.2 犬DEA3系统

犬的DEA3血型系统包含2种血型，即DEA3阳性和阴性。在早期对DEA3进行家族系统性研究中发现，DEA3是常染色体显性遗传。在1991年研制了针对DEA3的鼠单克隆抗体，但由于实验室保存中的事故，现已不存在。目前发现的犬DEA3阳性血型的犬比例非常少，在所有犬只中大约有5%～6%的犬是DEA3阳性。在赛狗中，DEA3的阳性频率大约为23%。在日本，Ejima等报道了DEA3阳性率较高的日本本土犬。有报道称在美国混血灰色猎犬和日本混血犬中有更高的出现频率，超过20%的阴性犬中会产生DEA3天然抗体，且这种抗体不会产生急剧的输血反应，但是能引发迟发型输血反应[11]。这种迟发型输血反应会使红细胞在输血5 d～7 d后从循环系统中瞬间消失。这种输血反应对依靠输血的非再生性贫血患犬有非常重要的价值，所以必须受到重视。

Hara等人确定了DEA3抗原在34 ku和71 ku之间有5条不同的蛋白条带。

1.3 犬DEA4系统

犬的DEA4血型系统包含2个抗原表型，DEA4阳性和阴性。这个血型系统是在美国、澳大利亚、加拿大、巴西和德国分别被独立鉴定。在美国、澳大利亚和巴西研究表明，DEA4阳性犬的几率为87%～95%，但在某些品种和地区的犬中，DEA4血型出现频率会明显低很多[12]。自然界中存在抗DEA4的天然同种抗体，但研究表明，DEA4并不引起严重的临床输血反应。此血型通常在特殊的实验室里用相应多抗试管法检测，当DEA4阴性犬接受DEA4阳性犬红细胞时会产生相应抗体，不会表现出输血反应，但也有DEA4阴性犬经过多次DEA4阳性红细胞输入后发生溶血输血反应[13]。DEA4阳性其他所有血型均为阴性的犬，被认为是万能供血犬。

Corato A等[14]确定DEA4分子质量在32 ku～40 ku之间的分子条带。

1.4 犬DEA5系统

犬的DEA5血型系统包含2个抗原表型，即DEA5阳性和阴性。这个血型系统在美国、澳大利亚和加拿大分别独立鉴定。到目前为止，这个血型系统是唯一经血型学鉴定存在的血型系统。已经发现部分犬体内存在天然的抗DEA5的天然抗体。经研究表明，经DEA5血型抗原致敏后，再次输血的红细胞存活情况与DEA3系统相似。目前发现具有DEA5血型犬极少，并且不存在天然的同种抗体，而将DEA5阳性的犬血液输注给DEA5阴性的犬所产生的排斥反应从第3天才开始，所以不会因为输血而产生严重的输血免疫反应[5]。在美国，针对此抗原有10%的犬会有天然的抗体存在。此抗原频率通常很低，但在美国的一些品种和地区会有一些变化，如在混血灰色猎犬中阳性率可高达30%，由此发生的输血反应为迟发型输血反应。

1.5 犬DEA6系统

目前对DEA6血型的研究报道有限，分为2个亚型，即阳性和阴性。这个血型频率在美国几乎在100%，在一些重要的品种和地区也有很大的变化。犬体内至今没有被报道过可以产生DEA6天然抗体，且有研究表明DEA6阴性犬接受其阳性红细胞后不会立即产生免疫反应，会轻缓并快速的清除输入的红细胞。现在也没有检测DEA6的多克隆抗血清。

1.6 犬DEA7系统

犬DEA7血型是较为常见的血型之一，存在2个等位基因，即DEA7阳性和阴性。分别在美国、加拿大和澳大利亚经过群体血型学检测独立报道。在这个血型系统中，Colling和Caison在1980年报道了第3个等位基因。研究发现，DEA7不是真正的红细胞抗原，是机体组织产生并分泌入血浆吸附到红细胞上的抗原物质。因此，称DEA7血型抗原为冷抗原，可以在输血前将血液加热到37℃，即可将抗原解除。这种可溶性膜抗原可以在唾液中和人类血型A抗原有关。Bull等研究表明，DEA7血型抗原不随骨髓移植而改变。在美国调查发现，大约有20%～40%的犬存在天然的抗DEA7的IgM抗体，并且滴度低，强度弱，在输入DEA7阳性犬红细胞后72 h内会清除其红细胞。在血型不符输血治疗中，致敏的个体可表现出不同强度的清除输注的红细胞。已经证明DEA7和血浆碱性磷酸酶之间有关系，DEA7阳性的犬血浆碱性磷酸酶S亚型显著不足。

Corato A等[14]确定DEA7分子质量在53、58、63 ku的3条蛋白条带。

1.7 犬DEA8系统

目前对DEA8血型的研究报道有限，最初被定义为He血型，是由同种免疫所得的抗血清区别发现的，此种血型出现的频率大概在40%～45%，不会立即产生免疫反应。现在也没有针对DEA8的多克隆抗血清。

1.8 其他血型

呈现在红细胞膜神经节苷脂上的唾液酸和神经氨酸决定了新的血型系统，其他血型系统可能存在并有重要的输血意义，但还未被标准化的鉴定出来。如Dal抗原是在混血达尔玛西亚犬中出现频率很高的血型系统[15]。但此血型在达尔玛西亚家犬上却很少出现，Dal血型抗体能产生剧烈的输血反应，至今还缺少此种血型抗体，所以此种血型的频率调查还没有相关报道，另外一些血型抗原在日本一些文献里相继报道过，有许多未定性的犬血型抗原，仍有着重要的输血意义。

2 DEA1.1血型频率研究现状

犬因血型错配会发生输血反应，严重时甚至致命，其中DEA 1.1的输血反应最迅速也最剧烈[16]。因此，在输血时应特别注意DEA1.1血型是否相配。传统上来说，犬临床输血的相容性很少被考虑，只有犬在第二次输血或者有免疫介导性疾病才会考虑[17]，但当评估犬的首次输血风险时，兽医临床工作者应该考虑血型的出现频率以及其天然抗体产生的频率。同一种的供血犬血型DEA1.1的出现频率为24%，DEA(1.1，3，5和7)血型天然抗体在受血犬中产生的概率为8%，则此次未配对输血产生免疫性输血反应的概率为32%。如果输血评估风险超过1/3，那么首次输血相容性的检测就非常重要，要想保证免疫输血反应最小化和输血有效性最大化，在输血前必须进行相关的输血相容性检查。DEA1.1作为最重要的血型抗原，在世界各国各个品种犬之间都有相应的频率调查，DeLuca L A等[18]在美国进行相应血型频率调查的血型频率为33%、36%、42%、54%和45%，Vriesendorp H M等[19]对于美国比格犬和金毛犬调查的血型频率为43.4%和29%，Ejima H等[20]调查得出日本比格和混血犬种的相应概率分别为38%和73%，Ferreira R R等[21]调查得出葡萄牙金毛犬和罗纳威犬的血型概率分别为88.9%和88.2%，Maria C M[22]调查得出美国灵缇猎犬血型概率为60.6%。在国内，牛光斌[23]对就诊的40只德国牧羊犬做过调查，发现其DEA1.1阳性率可达到85%以上。李华涛等在广东地区采集的356只犬的红细胞中，219(61.5%)只犬为DEA1.1阳性，134(38.5%)只犬为阴性。中国藏獒的DEA1.1阳性率可达90%，北京犬的阳性率可达55.6%，中国田园犬的阳性率为89%，这些品种均为国内品种，与国外文献报道的相关血型频率也有差别，地域性的不同致使相关的血型频率不同，且各品种犬DEA1.1血型频率也存在差异。国内兽医临床中常用本地犬作为供血犬，输血反应风险极大，建议不用本地犬作为供血犬，最好采用DEA1.1血型频率低的犬种作为供血犬，特殊情况需做木瓜酶介质交叉配血试验，并且要用显微镜观察结果，准确记录无反应才可输血。根据国内外报道的资料，据研究70%的灵缇犬的血型非DEA1.1，而且灵缇犬血液中很少含有红细胞抗原A1、A2、Tr因子，红细胞压积高[24]，静脉采血容易，可作为理想的供血犬，并通过交叉配血试验作进一步检测[25]。

3 犬血型的鉴定方法

随着输血医学在兽医实践中的使用范围不断扩大，让人们进一步认识到输血前血型鉴定及交叉配血的重要性，新的血型检测方法不断涌现。在兽医临床输血治疗中，血清学方法鉴定血型所用的方法和人类医学相似[26]，其中有试管法、卡片法和凝胶柱法等。作为犬最常见，也是输血反应最迅速最为强烈的血型，DEA1.1血型鉴定方法一直是人们研究的重点。Andrews G A等[27]在1992年成功研制出了抗DEA1.1血型定型鼠单克隆抗体。随后，宠物血液库(The Pet Blood Bank)等机构相继推出了可以检测DEA1.1和DEA1.2的血型试剂盒，基本满足了临床上对血型测定的要求。血型检测卡在20世纪90年代面世， 这些检测卡上具有冻干的血型检测试剂，对于犬的血型仅能够测试DEA1.1血型。该血型检测卡不管在实验室或临床诊疗中都已经标准化[28]。另外，研究人员最新研制的新型凝胶柱凝集测试血型检测方法可利用凝集反应来判断血型的类型。近年来，杜国浩等[29]又成功制备了DEA 1.1血型多克隆抗体，经符合率比对后确定有效并具有高血凝效价，为国内犬血型检测提供了保障，也为DEA 1.1血型单克隆抗体的制备及进一步研究DEA 1.1抗原结构打下了良好的基础。

交叉配血试验验证的供血者和受血者之间的血清学是否兼容，观察有无红细胞凝集和溶血反应。交叉配血不能替代血型鉴定,而是在血型鉴定的基础上,进一步验证受血者和供血者血型是否从而确保输血安全。犬第一次输血时，确定犬血型后，用盐水交叉配血方法确定供血犬与受血犬血型相合即可输血。如果犬并非首次输血，且不清楚先前输血时供血犬与受血犬血型相符，则须经更为灵敏和准确的凝胶柱凝集法等，确定血型相符后才能输血[30]。1907年首次报道人类医学的交叉配血试验, 交叉配血试验检测的临床价值较高[31]，有盐水法[32]抗人球蛋白法、木瓜蛋白酶法、微柱凝集法和凝聚胺法等[33]。在兽医临床中，盐水凝集或间接抗球蛋白实验经常用于交叉配血，但该方法因耗时或繁琐而不被临床实验中使用。另一种检测方法是凝胶柱凝集方法，该方法耗时少，容易标准化，并且容易判定结果，可长期保存用于结果查看。目前，DiaMed和DMS实验室可生产商业化的凝胶柱犬猫交叉配血试剂盒。

4 展望

犬血型系统的研究对犬血型鉴定有重要作用，可靠的血型鉴定可明显增加输血安全，降低输血反应，在反复输血医疗中可以最大限度延长动物寿命。现在可用的动物血型分型的方法都是基于红细胞抗原和单克隆试剂或多克隆血清的血凝反应原理实施的，基于目前的情况，对犬血型的研究集中在血型基因型方面会更有意义。另外，犬血型的鉴定需通过红细胞抗体检测方法和血型抗体筛选方法，这都避免不了用到试剂红细胞但其不能够长期保存，这样进一步加大了血型抗体的筛选工作难度，限制了输血治疗方法。因此，亟需研究出一个常规的方法，既可以长期保存血型抗原，又可以高通量的进行血型抗体检测。

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