实验用小尾寒羊脊柱外科手术围手术期管理的探讨

张 阔，孙海明，田 枫*，司 雨，杨 辰，林国忠，韩 婕，郑振辉

(1.北京大学医学部实验动物科学部，北京 100191；2.北京大学第三医院，北京 100191；3.北京积水潭医院，北京 100035)

实验动物是生命科学研究和发展中重要的基础和支撑条件，科研人员进行动物实验建立动物模型是医学基础研究中不可或缺的重要组成部分[1]。当基因修饰动物模型及化学和物理方法造模不能达到预期动物模型效果时，外科手术制作动物模型是不可替代的重要手段。通过实验外科方法制作疾病动物模型，对于疾病的基础研究和临床研究具有不可替代的意义[2]。小尾寒羊颈椎与人颈椎在解剖结构、运动特点、椎骨密度及生物力学等诸多方面有很多相似性，非常适合进行人颈椎相关疾病的研究[3]。小尾寒羊在脊柱外科研究中的应用越来越广泛，对揭示颈椎病理变化、制定治疗方案及提高治疗效果发挥了重要的作用。近年来我们共进行了百余例小尾寒羊的外科动物实验，其中包括颈部脊髓压迫模型、人工椎体植入、颈椎椎板切除模型、腰椎体间融合模型及颈部椎体手术方式等脊柱外科相关实验。实施规范化围手术期管理是小尾寒羊脊柱外科手术成功的前提与保障。本文结合本部多年来进行小尾寒羊脊柱手术围手术期的管理经验及处理要点，旨在为从事相关动物实验人员提供有益的经验与借鉴。

1 术前管理

1.1 保证动物福利

实验人员在实验开始前必须向实验动物福利伦理委员会提交正式申请书。申请书包括以下内容：动物实验项目名称及概述，项目负责人、执行人的姓名、专业背景简历、实验动物从业人员培训证书编号、环境设施许可证号、项目的意义、项目的必要性、项目中有关实验动物的用途、饲养管理及实验处置方法、预期出现的对动物造成的伤害、处死动物的方法、项目进行中涉及动物福利和伦理问题的详细描述，遵守实验动物福利伦理原则的声明。北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会在实验动物福利伦理审查中根据如下的基本原则进行审查：审查动物实验的必要性，对实验目的、预期利益与造成动物的伤害、死亡等进行综合的评估。保证实验动物生存时包括运输中享有最基本的权利，享有免受饥渴、生活舒适自由，享有良好的饲养和标准化的生活环境，各类实验动物管理要符合该类实验动物的操作技术规程。应充分考虑动物的利益，善待动物，减少动物的应激，尊重动物生命，制止针对动物的野蛮行为、采取痛苦最少的方法处置动物。实验动物项目要保证从业人员的安全，动物实验方法和目的符合人类的道德伦理标准和国际惯例。在本部进行小尾寒羊脊柱手术相关的医学动物实验，均由北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会进行审查经批准同意后方可进行实验，而且必须严格按动物伦理审批项目的规定执行[2]。

1.2 人畜共患病检测及控制

小尾寒羊属于试验用动物并非标准实验动物，目前关于试验用羊尚无国家标准和地方标准可依。羊的人畜共患病有炭疽、布鲁菌病、口蹄疫、钩端螺旋体等多种疫病。2010年某高校师生在羊活体解剖学实验课中感染布鲁菌的事件为实验动物从业人员敲响了警钟，提示在实验外科相关动物实验中应有效防控实验用动物的人畜共患疾病[4]。因此，在用羊进行动物实验前，应进行布鲁菌病等人畜共患疾病检测，以保证实验人员的安全。布鲁菌的平均潜伏期是2周至几个月不等，羊在订购后，应单独圈养，隔离观察。分别在订购时、饲养场隔离观察时及进驻实验单位前进行3次布鲁菌病等人畜共患疾病检测及驱除体内外寄生虫。3次术前检疫后，为了保障实验动物从业人员的安全，术后还应进行术后定期监测，以每2周～6周监测1次为宜，每次检测均应由有资质的检测机构出具正式检测报告。我们通过人畜共患疾病的检测筛选出符合实验要求的小尾寒羊，有效的保证了试验用羊的质量，从而为开展小尾寒羊的动物实验提供安全保障。只有制定严格的隔离检疫制度并及时检测人畜共患疾病，才能避免严重感染事件的发生[5]。

1.3 动物健康检查

小尾寒羊应在手术前2周～4周进驻动物实验中心，适应新环境。由兽医进行术前健康评估，根据疾病史、体格检查、营养需要、行为类型及当地羊场发病情况进行诊断、检测来评估每只羊的健康状况。小尾寒羊合群性强，喜欢互相跟随，离群的羊应引起实验人员重视，羊群快速行走时，尤其应重点对落伍的羊进行全面的临床系统检查[6]。手术前应对每一只羊进行全身各系统的健康检查，结合临床症状可进行血常规、血生化及心电图的检测。动物出现异常情况或发现疾病的临床表现时应立即隔离进行鉴别诊断，并给予治疗，不可进行手术等相关实验。通过有效的动物体格检查及特殊检查方法排除异常症状从而提高手术成功率。如发现重大传染病，应向有关部门上报，按照应急预案操作程序进行处理。

1.4 术前饲养管理

小尾寒羊属反刍动物，以草食为主，具有发达的采食和消化系统。有瘤胃、网胃、瓣胃及皱胃4个胃，前3个胃的黏膜无腺体组织，合称前胃，皱胃黏膜内分布有消化腺，所以称真胃。其中瘤胃不能完全排空，在麻醉时极易发生瘤胃胀气引起胃内容物返流和吸入性肺炎，在麻醉中为常见的麻醉并发症，在麻醉前应作适当的预防措施减少出现此类并发症[7]。术前48 h观察小尾寒羊的腹部臌胀情况，如腹部臌胀明显，为前几日进食较多，术前禁食48 h。腹部臌胀不明显，术前禁食24 h，禁水12 h。

1.5 术前准备

在实验前对动物进行全面体检后，做好术前实验记录，记录包括：动物编号、体重、年龄、性别、血压、心率、体温及血氧饱和度等监测参数，观察动物的行为以确保动物健康。术前准确称取动物体重，不仅可准确计算麻醉及治疗用药剂量，而且便于对比术后体重，评估观察动物术后的健康状况。此外术前应进行手术区域的备皮，剔除羊毛范围应比手术区域略大为宜，规范的术前备皮可以减少术后切口感染几率。

2 术中管理

2.1 麻醉诱导

麻醉前皮下注射阿托品0.05 mg/kg～0.1 mg/kg减少气管和唾液腺分泌，降低气道阻塞的危险。静脉注射丙泊酚4 mg/kg～8 mg/kg进行诱导麻醉。动物用药后表现出呼吸和心率加快，眼睑反射存在，1 min～3 min后肌肉紧张度下降、眼睑反射消失、呼吸和心率平稳，可进行气管插管。进入麻醉状态后眼保护性反射消失，使用眼药膏减少角膜干燥和损伤的危险。

2.2 气管插管

小尾寒羊的开口度有限，腭间空间狭小，会厌部远离口唇，行气管插管较其他动物困难程度更高。待麻醉平稳后，立即进行气管插管。动物采取仰卧位保定、颈部伸直的状态下，由助手放置开口器撑开口腔，用舌钳将羊舌头拉出。麻醉师左手持专用喉镜，压迫舌面，并向前推进，在喉镜灯光引导下暴露会厌部，用喉镜挑起会厌软骨，暴露声门，右手持改良含导丝的8.5号气管插管，待动物呼吸声门打开时，迅速插入气管，深度约20 cm左右。抽出导丝，助手挤压动物胸部，可以闻及气管插管内急速气流声音。静置片刻，动物呼气时可见气管插管内壁有呼吸道水蒸气冷凝附壁现象。插管成功后，向气囊内注射约10 mL空气，使气囊处于膨胀且有弹性的状态，将气管插管固定在特制口腔固定器内。

2.3 动物保定

保定方法需根据手术操作而定，后路手术需要折叠手术台为“V”字型，并在颈部下方放置支撑三角形颈托。前路手术需要动物仰卧，颈部放置平板型颈托。保定时应采用较宽且柔软的绑带捆绑四肢，绑带固定部位过紧或手术时间较长，容易导致组织损伤和肢体末端水肿，加重动物术后痛苦。动物保定方法达到手术要求后，开启手术台恒温加热功能，保持适宜体温，减少热量丢失。

2.4 开通静脉通路

手术中经常需要打开深部组织，造成体液水分丢失，需术前开放静脉通路。开通静脉通路不仅能维持动物术中的循环体液稳定而且便于术中治疗药物的静脉注射。颈部静脉穿刺开通静脉通路，在保定时穿刺针容易脱出，且影响颈部手术操作。小尾寒羊耳部静脉表浅、明显，是进行表浅静脉穿刺的良好选择。耳部静脉穿刺置静脉留置针成功后，应用适宜的纱布卷贴附固定留置针，能够保持穿刺针稳定固定在静脉内。随后将留置针连接输液器及生理盐水，进行静脉滴注。

2.5 吸入麻醉

同注射麻醉剂相比，大多数吸入麻醉剂都可迅速地被吸收和排除，因此吸入麻醉更容易被控制[8]。使用异氟烷进行吸入麻醉，动物麻醉平稳后行气管插管，接吸入麻醉机进行异氟烷吸入麻醉。使用紧闭回路的呼吸管路为22 mm双支回路，5 L的呼吸气囊，氧流量控制在1 L/min～3 L/min，麻醉师根据动物生命体征监测指标状况及手术操作需要调整麻醉气体的浓度(2%～5%)，在手术过程中使动物保持麻醉平稳状态。

2.6 术中生命体征监测

在小尾寒羊的脊柱外科手术过程中，通过对麻醉动物生命体征的监测来评估动物个体，便于发现问题及时采取有效的处理措施，从而减少麻醉意外的发生。麻醉药物均有危险性，保证麻醉安全的重要措施是有效细致的监护。首先采取生理性监护方法，对动物进行听诊心率、触诊脉搏、观察可视黏膜颜色等生命体征进行临床观察。其次结合机械性监护方法，借助监护仪器设备监测血氧饱和度、心电图、血压、心率、呼吸频率及体温等指标[9]。不同监测方法重叠监护能够提供更多有益信息，发现监测指标的差异性，以便确定是否存在麻醉风险。麻醉绵羊的正常生命体征为：心率80次/min～150次/min，呼吸频率20次/min～40次/min，体温为38.6℃～40℃，收缩动脉压10.7 kPa～16 kPa，平均动脉压10 kPa～14.7 kPa，舒张动脉压8 kPa～10.7 kPa，动脉二氧化碳分压3.7 kPa～4.8 kPa，动脉氧分压9.6 kPa～12 kPa[6]。参考正常生命体征参数监测术中麻醉的动物是十分必要的，麻醉药的过量使用会导致心力衰竭，如紫绀、血压下降、心率变化、甚至心脏停搏。麻醉药使用不足，会导致动物在手术中苏醒，造成动物的明显痛感，有悖于实验动物的伦理原则。血氧饱和度监测比观察气管插管的呼吸次数，能更早期发现呼吸相关问题并及时的予以处理。小尾寒羊监测舌部的血氧饱和度时，应在舌部外面覆盖湿润盐水纱布，避免舌部干燥。如果血氧饱和度过低，首先应检查气管插管是否被异物堵住，防止小尾寒羊窒息死亡。术中小尾寒羊血氧饱和度降低常为气管插管不通畅，或者插管脱出所致。而气管插管不通畅的常见原因是喉部分泌物过多，应适量增加阿托品的用量，并及时用负压吸引器吸出分泌物。插管脱出应暂停手术，及时再次实施气管插管置入术。通过血氧饱和度、心电图、血压、心率、呼吸频率、呼气末二氧化碳及血气分析等监测手段，综合评估动物在麻醉手术中的整体情况可以及时发现异常生理情况，采取有效相应的措施进行监护和治疗，保证在整个手术过程中动物保持麻醉平稳状态，避免出现麻醉并发症造成麻醉意外。

2.7 手术操作注意要点

小尾寒羊颈前路手术入路中存在多个重要结构，手术时注意对颈动脉、颈静脉和椎动脉的保护。这些血管均为主要枝干，损伤后可导致大出血，处理困难，导致实验动物的死亡。避免过度牵拉食管和气管，食管和气管损伤后当时无明显异常，但术后却可引起纵膈感染，病死率较高。术中、术后充分止血，因颈部前方结构多体积小，易形成血肿压迫气管，严重时可造成实验动物的死亡。在颈后路手术入路中小尾寒羊与人类颈部解剖结构最大不同点在于项韧带、椎板宽度、椎板厚度、椎板硬度和椎管大小。小尾寒羊的项韧带比人类发达，对颈部运动影响极大，应尽量减少对其的损伤。小尾寒羊的椎板比人类倾斜角度大，且宽度小，可操作空间小，更需要实验人员充分了解其解剖特点，仔细设计手术方式，减少非必须的骨质破坏。小尾寒羊椎板厚度大于人类，不可依据常规临床手术经验，而是应在直视状态下，用高速磨钻逐次、细致的磨开椎板。一般来说，对小尾寒羊实施椎板手术的时间要明显多于临床上的椎板手术时间。此外小尾寒羊的椎管内径较人类小，所以手术中，如果需要暴露椎管，一定要十分小心，非常容易损伤脊髓，造成术后动物活动障碍，甚至截瘫。缝合皮肤时，进行外翻缝合。因羊毛生长速度快，如手术切口内存在毛囊，术后短期羊毛生长出来后，可以造成局部的炎症反应，甚至延缓手术切口的愈合。

3 术后管理

3.1 麻醉苏醒期处理

术后麻醉苏醒期动物需要温暖、安静、光照柔和的苏醒环境，室内温度维持在21℃～24℃。动物避免口鼻和眼睛上粘附木屑、刨花及玉米芯等垫料，手术伤口远离动物粪尿污染的垫料。多数异氟烷吸入麻醉的小尾寒羊在术后完全苏醒能够站立行走后放入苏醒室。如未能及时苏醒站立行走，选取向一侧体位摆放动物体位，伸展头颈，将部分舌拉出口腔外，减少呼吸道堵塞的风险。术后护理应由专业技术人员进行观察，及时了解动物状态采取相应的治疗和处理措施。虽然无菌技术能够减少术后抗生素的使用，但是无法避免粪尿及饲养环境污染伤口，术后预防性使用抗生素可减少伤口感染的发生。

3.2 术后饲养管理

术后观察小尾寒羊的饮食、活动情况，观察其精神状态和对刺激的反应，记录其摄食量、饮水量、粪便和尿液的排出量，并重点观察手术切口的情况。术后应注意饲养环境的卫生清洁，保持环境条件的稳定，减少术后感染的发生，饲喂易消化的饲料和清洁饮水。必要时进行术前与术后体重比较，结合生命体征监测进行静脉补充9 g/L生理盐水或50 g/L葡萄糖液，动物手术后1周内使用止痛药作为常规治疗，减少动物的应激、痛苦和伤害。

4 讨论

小尾寒羊适应性好，生长发育快，肉毛兼用，在我国分布较广，是我国优良绵羊品种之一[10]。在椎体、椎管、椎弓根、椎骨密度等方面与人类颈椎的变化趋势有很多相似性[11]，成为研究颈椎病发生、发展和转归的重要实验用动物。虽然在比较医学研究中小尾寒羊尚属于试验用动物并非标准实验动物，但是因其特有的生物学特性及解剖特点成为科研人员建立外科实验动物模型的理想选择。

小尾寒羊脊柱手术围手术期的管理需严格按动物伦理审批项目的规定执行实验方案，充分考虑动物的利益，善待动物，减少动物的应激、痛苦和伤害，尊重动物生命，采取痛苦最少的方法处置动物从而保证动物福利。只有制定合理的隔离检疫制度，及时检测人畜共患疾病，才能筛选出符合实验要求的小尾寒羊为动物实验提供安全保障。在麻醉过程中根据实验需要充分做好麻醉前的准备工作，采用丙泊酚静脉注射诱导麻醉、进行经口气管插管、开放静脉通路、异氟烷吸入麻醉、生理性结合机械性生命体征监测等改良新技术方法，有效保证了多例小尾寒羊脊柱外科手术的顺利完成。相比以往肌肉注射速眠新等麻醉药物进行全身麻醉小尾寒羊的方法，明显提高了动物手术成功率，减少了麻醉并发症造成的麻醉意外，对于实验用羊外科手术的麻醉是一种安全、有效、易操作、值得推广的麻醉方法。

小尾寒羊脊柱外科手术围手术期管理中尤其应注意如下要点：①手术体位放置：前路颈椎手术时动物保定体位为仰卧位，而对于后路脊柱手术，动物术中处于俯卧位。体位放置前需要详细的考虑和周密计划以及正确的配合和充分的人手。进行脊柱手术保定及搬运动物过程中，动物头部大多数被牵引，禁忌扭转、过曲或过伸。及时固定头颈部，尽量减少头颈的活动次数和幅度，保持颈椎的稳定性，避免颈深部血肿的形成，保持呼吸道通畅[12]。特别是在动物使用麻醉药及肌松药后危险性更高，有相关报道出现了新的神经功能缺失症状[13]。②呼吸道管理：由于颈前路手术中对气管和食管的牵拉刺激，术后动物呼吸道分泌物常增多，易形成痰液堆积。实验动物的手术切口疼痛无力将痰咳出。术前行气管插管能够有效保证呼吸道通畅，术后给予地塞米松及沐舒坦等药物对症治疗，可减轻呼吸道炎症、水肿，稀释痰液，使其易于排出[14]。③手术并发症观察与护理：手术器械对脊髓的直接压迫，手术环钻的震动，切除脊髓的骨片时骨片对脊髓的冲击及硬膜外血肿直接压迫脊髓等均可造成神经根损害、脊髓损伤加重。麻醉清醒后应进行观察颈椎活动范围、注意前肢与后肢两侧活动是否对称、肢体自主活动程度、躯体运动障碍、排粪排尿功能障碍甚至瘫痪等现象。发现异常及时采取必要的治疗措施，以减少后遗症发生[15-16]。

根据实验用羊的生物学特性在围手术期间应重点注意手术过程中瘤胃臌气、胃内容物返流、吸入性肺炎、通气不足等并发症的发生，合理的麻醉方法和充分的麻醉前准备工作可以避免这些并发症的发生几率。术前手术区域的规范应仔细备皮、消毒、铺巾，穿戴手术衣、口罩、手术帽，预防性给予抗生素均可以减少动物的感染几率，促进切口恢复。术中麻醉师和术者积极配合，通过血压、心率和血氧等指标监测动物循环和呼吸功能，即可保证最少的麻醉药剂量，保证术后动物尽早苏醒。虽然现在有多种广谱抗生素，但无菌操作仍然需要严格遵守。实验动物的麻醉、外科手术等实验后机体容易受到较大的损伤，发生异常病理、生理反应，此时易遭到微生物、寄生虫侵袭，从而影响实验结果的科学性和准确性。因此在动物实验的围手术期间应严格控制影响动物实验因素，规范管理围手术期的各环节，适时采取相应措施保证实验动物完全康复，达到预期实验目的。

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