犬瘟热病毒H、F和N基因的克隆及原核表达

包福祥 阿米娜 芦婷 赵鑫鑫 钱英红 杜雅楠*

1.内蒙古农业大学兽医学院

2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室

3.内蒙古自治区农牧业科学院

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)为负链RNA病毒，属于副黏病毒科麻疹病毒属，可引起犬科、鼬科和浣熊科动物的急性、高度接触性、致死性疾病，该病的主要传染源为患病动物和隐性感染的带毒动物。目前，犬瘟热常年发生，呈散发、地方流行，传染性强、发病率和死亡率高，是养犬业、经济动物养殖和野生动物危害最大的疾病之一。CDV由15616个核苷酸组成，编码基因按3’～5’端排序依次为：3’端前导序列、核衣壳蛋白基因（N）、磷蛋白基因（P）、基质蛋白基因（M）、融合蛋白基因（F）、血凝素蛋白基因（H）、聚合酶蛋白基因（L）和5’端引导序列。研究表明，CDV的N、F和H三种蛋白在病毒感染和宿主免疫方面起主要作用。因此，H、F和N蛋白的克隆和表达将对CDV的诊断和治疗具有非常重要的意义。

一、材料和方法

1.材料

（1）主要试剂。英特威犬四联疫苗（宠必威）由内蒙古农业大学教学兽医院刘俊平教授提供；Trizol试剂为Invitrogen产品；反转录试剂盒购自Promega公司；T4连接酶为NEB公司产品；Ex-Taq DNA聚合酶、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、DL2000、DL5000 Maker、pMD19-T（Simple）Vector、EcoRI、XhoI、BamHI限制性内切酶均购自Takara公司；大肠杆菌Trans-T1感受态、Transetta (DE3)感受态购自北京全式金公司；Ni-NTA Sefinose(TM) Resin购自生工生物工程(上海)股份有限公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购自碧云天公司。

（2）PCR引物。根据GenBank中发表的CDV Onderstepoort毒株基因序列，用Primer premier 5软件设计了三对特异性引物H1/H2、N1/N2、F1/F2，引物序列如表1所示，并在PCR产物上、下游分别引入酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。……