丝蛋白材料的三维打印

孙 放

(苏州大学纺织与服装工程学院, 江苏 苏州 215021)

通过一定浓度的溴化锂溶液温度处理脱胶过的蚕丝，可获得丝素蛋白溶液。天然丝素蛋白因其良好的生物相容性、可降解性、无毒无害、表面有多种官能团(易于各种官能团交联)、良好的可成型性(可以制成支架、膜、多孔海绵、水凝胶、纤维、颗粒等不同形态)，在生物医学等领域有着广阔的应用前景。三维生物打印是制备支架的一种新方法，利用计算机辅助软件来设计和制造各种形状的三维支架，可以精确控制支架的孔径大小和分布，成型时间短，适合自动化大规模生产。丝蛋白三维打印存在的一个关键问题是如何改善蚕丝蛋白的快速凝胶成型的问题。

1 丝素蛋白的结构性能及应用

1.1 丝素蛋白的结构与理化性能

蚕丝(如图1所示)的主要成分是丝素和丝胶，丝素蛋白是蚕丝最主要的组成部分，占总质量的70%左右，是一种天然高分子纤维蛋白，含有18种氨基酸以甘氨酸(Glycine)、丝氨酸(Serine)和丙氨酸(Alanine)为主，丝素蛋白包括一条相对分子质量很大的肽链(H链)、一条相对分子质量小的肽链(L链)以及p25糖蛋白，丝素存在两种不同的晶体结构方式，丝素Ι(Silk Ι)和丝素Ⅱ(Silk Ⅱ)，丝素Ι是不稳定的而丝素Ⅱ是稳定的，丝素Ι经过极性溶剂、稀酸、湿热等的处理会变成稳定的丝素Ⅱ结构[1]。丝素蛋白的结晶部分以β-折叠为主，不能溶于水只能变得膨胀，也不溶于有机溶剂，如乙醇等，但是可以在某些中性盐溶液中无限扩张而得到粘稠的液体，经过透析除去盐可得到丝素的纯溶液[2]。丝素蛋白具有良好的物理机械性能，如透气、透湿，缓慢释放，抗拉强度好、柔韧性好等优点。

图1 蚕丝蛋白的主要成分及结构示意图

1.2 丝素蛋白的生物性能

丝素蛋白是天然的高分子蛋白，具有很好的生物学性能：(1)安全性：丝素是天然的高纯度蛋白质，氨基酸排列顺序是已知的，用于手术缝合线已有很长的历史；(2)可设计性：丝素具有四种高级结构(无规卷曲、丝素Ι、Ⅱ、Ⅲ型)，它们之间能够相互转化，丝素经过不同的处理可以得到各种形态，如纤维、溶液、粉、膜、水凝胶以及三维支架等，也可以与其他材料复合来改善丝素的结构与性能；(3)生物相容性：多种细胞可以在丝素蛋白上很好地黏附、生长、增殖和分化；(4)特殊的性能：丝素蛋白有良好的机械性能，可以在体内降解并且速度缓慢可调，还拥有良好的促进血管化的能力，优良的透水透氧性能[3]。

1.3 丝素蛋白的应用

由于丝素蛋白良好的性能，现已将丝素蛋白用于食品、化妆品、医药等领域，丝素蛋白可用作人工皮肤、细胞培养基质、生物传感器、药物控释材料、生物酶防护剂、隐形眼镜、抗凝血材料、酶固定剂等[4]。Meinel等[5]在骨组织修复中使用丝蛋白三维多孔支架，他们的研究表明这种支架稳定可靠，可用于骨组织再生修复。Ma Liang等[6]用全物理过程制备三维的多孔丝素蛋白支架，将鼠hMSCs与上述素支架在体外复合培养，实验结果表明hMSCs能在丝素上良好地粘附、增殖和生长，材料未影响细胞的生长周期，没有检测到异倍体细胞，支架材料与hMSCs的生物相容性好。Lin Jing等[7]研究丝素支架的细胞相容性，在丝素多孔支架上培养成纤维细胞、人成骨肉瘤细胞及肝细胞，结构表明这些各种动物细胞能够很好地黏附生长和繁殖在所制备的丝素多孔支架上。

2 明胶的结构性能及应用

2.1 明胶的结构与性能

A.G.Ward认为，胶原经温和而不可逆的断裂后的主要产物为明胶[8]。胶原是大型哺乳动物的骨、皮、肌腱和韧膜等组织细胞外基质的主要成分，对机体和器官起着保护和支撑的作用，胶原具有三股螺旋结构，明胶是胶原的三股螺旋结购破坏后形成的不规则盘区的螺旋卷曲状线性肽链分子[9]。明胶分子结构上有大量的极性基团(-OH、-COOH、-NH2)，这使得明胶具有极强的亲水性。明胶易溶于温水，冷却形成凝胶，不溶于冷水，在冷水中吸水膨胀，不溶于有机溶剂，明胶含有甘氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸及丙氨酸等人体所需的氨基酸，其中甘氨酸占总量的三分之一，脯氨酸和羟基脯氨酸占总量三分之一[10]。

明胶是天然的高分子蛋白，在结构上，明胶与生物组织很相似，明胶除了有很好的生物相容性之外，还有生物可降解性，得到的降解物不容易有炎症反应且易被吸收，此外还具有低免疫原性、抗氧化性和抗菌性[11]。

2.2 明胶的应用

明胶在食品、照相、化妆品等工业领域有着广泛应用。食用明胶可以用于食品添加，提升食品的口感和外观，营养价值较高；照相明胶主要用于制造感光材料，如拍照时使用的胶卷和胶片等；化妆品中的明胶、胶原及其水解产物对头发和皮肤等具有修复、去污、保湿的功效。明胶由于其优良的生物性能，在生物医药材料中的应用也很广泛，明胶可制作药物胶囊、止血敷料、血液代用品、组织工程支架等[10-11]。

3 丝素蛋白的三维打印

3.1 三维打印及应用

三维打印(Three Dimensional Printing，简称3DP)，也称添加制造(Additive Manufacturing，AM)，是一种新兴的快速成型技术。它是在计算机的控制下，以物体的计算机辅助设计(CAD) 模型或者计算机断层扫描(CT) 等数字模型文件为基础，通过分层加工、逐层叠加材料(包括液体、粉材、线材或块材等)的方式来构造任意形状的3D物体的技术。

图2 三维生物打印示意图

三维打印于20世纪90年代由美国麻省理工学院(MIT)首次发明，被认为是制造领域的一次重大突破，也被众多行内人士和国内外媒体誉为“第三次工业革命重要生产工具”。三维打印常用在模具制造、工业设计等领域，现在不仅用于传统制造领域，而且还被成功地运用到了医学与生物医学工程中[12-16]。目前，三维打印设备和可供三维打印的材料不能满足三维打印的需求，尤其是可供三维打印的材料。三维打印技术所用的材料主要是经过特殊处理的粘合剂和高分子材料，并且要求材料有很好的固化反应速度。作为可用于三维打印的材料，要求可以快速并且精确地成型，不同的三维打印技术有着各自对于材料的要求，可以说可供三维打印的材料的研发，极大地影响了三维打印技术的发展[12]。现阶段，应用广泛的三维打印技术主要有：熔融沉积成型(Fused Deposition Modeling) 、光固化立体印刷(Stereo Lithography Apparatus )和粉末材料选择性激光烧结(Selective Laser Sintering) 等[17]。

近年来，三维打印在机械设备、生活用品、生物医用材料，甚至是活体器官等领域得到迅速发展。在生物医学领域，三维打印技术已经应用于制造个性化组织工程支架、器官模型和假体植入物，还用于策划和分析手术方案，甚至可以直接打印出组织和细胞等[16]。

3.2 三维生物打印的研究现状

组织工程用于制备丝素多孔支架的传统方法有：相分离/冷冻干燥法、制孔剂法、静电纺丝法、气体发泡法等[17]。然而，这些技术的缺点包括高毒性的有机溶剂的大量使用，制备期间太长，过程劳动过于密集，在聚合物基体中的残余颗粒的不能完全去除，重复性差，孔的形状不规则，孔隙以及薄壁结构的互通不充足，此外，大多数这些方法对形状控制有限制[18]。三维打印法(快速成型)是制备三维支架的一种新方法，是利用计算机辅助软件来设计和制造各种形状的三维支架，可以精确控制支架的孔径大小和分布，成型时间短，适合自动化大规模生产，使用方便、易消毒，对溶液表面影响小，具有其它方法没有的优点[19]。

Skander Limem等[20]将0.6%的丝素水溶液喷墨打印在聚乙烯塑料基底上，然后在打印出来的丝素线上种植人体骨髓干细胞，在100ng/mL的BMP-2存在的条件下培养，一周后细胞开始生长并粘附在丝素线上。Sourabh Ghosh等[21]将丝蛋白通过一个安装在三轴计算机控制平台上的微细喷嘴沉积到富含甲醇的储液器中，以使得沉积的纤维通过诱导结晶进行快速凝固，通过实验证明直写组装的三维丝素蛋白支架支持人类骨髓间充质干细胞(hMSC)的粘附和增长，在这些支持支架上软骨细胞条件下培养的细胞与标准微球培养相比，由于增加的糖胺聚糖的产量，所以提高了软骨细胞的分化，三维丝素蛋白支架由于其支架结构的精确控制及其生物相容性，可能会在组织工程构建上有潜在的应用。Lin Sun，Sara T.Parker等[22]将丝素与羟基磷灰石混合，利用直写组装打印出三维支架，这种方法可以对于打印出的支架中的长纤维的大小和位置做出精确控制，然后将hMSCs和hMMECs混合培养在这些三维支架上，hMSCs和hMMECs在丝素和羟基磷灰石的三维支架上的细胞外基质形成了错综复杂的网络。

尽管丝素蛋白拥有许多优异的性能，不过和很多人工合成高聚物相比，未经处理的丝素蛋白支架因其结晶度低，导致强度低、易破碎等缺陷，而且丝素蛋白溶液品质受到原料质量影响。为了改善丝素蛋白的结构和特性以得到理想的组织工程支架材料，可以通过对丝素的理化性能进行改进或者与其他多聚物复合来得到，丝素蛋白主要与壳聚糖、硅酸钙、羟基磷灰石、明胶、胶原蛋白、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等材料复合来制备组织工程支架[2,17]。Li Mingzhong等通过丝蛋白和明胶共混，制备一种断裂伸长和弹性模量等性能均比纯丝素蛋白溶液制成的膜性能都好的膜[23-24]。Yin Lihua等[25]用冷冻干燥技术制备丝素明胶三维支架，发现明胶的加入有利于稳定支架的结构以及提高支架的热稳定性。

4 前景和展望

利用三维打印制备生物支架与运用传统方法制备生物支架相比，存在可以控制支架的形状和结构，从而使其满足不同领域的应用要求的优势；丝素和明胶都有很好的生物相容性，且明胶的加入可以改善丝蛋白的凝胶成型性，是很好的生物支架材料。三维打印制备丝素蛋白基支架结合了三维打印和明胶与丝蛋白混合两者的优点，产品存在潜在的应用前景。

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