丹参总酚酸纯化工艺研究

徐桃枝 晏永新 何爱英 廖春玲

(1.江西省医药学校，江西 南昌 330200；2.江西新世纪民星动物保健品有限公司，江西 南昌 330096)

引言

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根茎，其有效成分包括水溶性成分和脂溶性成分[1]。丹参是活血化瘀的常用中药，广泛应用于治疗心血管疾病的中药复方中。水溶性丹参酚酸类是丹参的主要有效成分之一，具有抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等作用[2]，是治疗冠心病的主要有效成分[3-4]，其中丹酚酸B约占70%。丹参水溶性成分的提取方法多采用水提醇沉法，此方法溶剂消耗大，有效成分有明显损失。本研究采用分离效果较好的大孔树脂分离技术，对丹参总酚酸进行纯化研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

对照品丹参酚酸B，中国药品生物制品检定所提供；丹参购于江西省樟树中药材市场；AB-8，D101，NKA-9型大孔吸附树脂；Agilent 1200型液相色谱仪，VWD检测器，含在线真空脱气机、四元梯度泵、柱温箱；色谱数据的采集与处理由Agilent化学工作站完成；超声波清洗仪；电子天平(十万分之一)；甲醇为分析纯和色谱纯两种，乙醇；甲酸；水为重蒸馏水等。

1.2 色谱条件与系统适应性试验

采用HPLC法测定样品中丹参酚酸B的含量。取丹参酚酸B对照品适量，精密称定，加流动相制成1mL含丹参酚酸B149.76μg的对照品溶液，分别精密吸取2、4、6、8、12、16、20μL，注入色谱仪，按照以下方法测定：色谱柱：迪马DiamonsiLTM(钻石)C18(5m，250×4.6mm)；流动相：甲醇-乙腈-0.4%甲酸(37∶7∶56)；检测波长：285nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。以对照品的浓度(μg/ml，X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。得到丹参酚酸B线性方程为：

y=1443.8x-4.3685(r=0.9997)，线性范围为0.3744～3.744μg。该方法线性关系良好，回收率为99.89%。

2 纯化工艺研究

2.1 纯化方法的比较

据文献[5]报道，醇沉法是中药水提取液常用的精制方法，但其对化学成分影响较大，近年来，随着大孔树脂吸附法的兴起，取代传统醇沉法的研究越来越多。为了确定较好的精制方法，本研究对这两种方法进行了比较，结果见表1。

(1)醇沉法

取丹参提取样品液(1g生药材·mL-1)800mL，均分为8份，每份100mL，每份相当于100g生药，加乙醇至含醇量分别为50%、60%、70%、80%，每一浓度平行各做2份。冷藏过夜，抽滤，滤液定容到500mL，精密吸取5mL至100mL量瓶中，用水稀释至刻度，测定浸膏得率，并用HPLC法测定丹酚酸B的含量。

(2)大孔树脂吸附法

取丹参提取样品液(1g生药材·mL-1)200mL，均分为2份，每份100mL，每份相当于100g生药，分别离心(4000r/min，15min)，倒出上清液，加适量的水返溶沉淀部分，离心，合并两次离心液，上AB-8型大孔吸附树脂柱(生药量：树脂量=2：1)。待药液流尽后，加入蒸馏水洗到Molish反应为阴性，再用30%的乙醇洗脱有效成分。将洗脱液浓缩，定容至500mL，精密吸取5mL至100mL量瓶中，用水稀释至刻度，测定浸膏得率，并用HPLC法测定丹酚酸B的含量。

表1 不同的精制方法的比较研究

醇沉法浸膏得率明显高于大孔树脂吸附法，且提取物中丹酚酸B的含量较低，不符合除杂精制的要求。大孔树脂吸附法对丹酚酸B保留率和醇沉法没有很大的差异，但提取物中丹酚酸B的含量将近40%，达到了实验精制的要求，故选用大孔树脂吸附法纯化精制丹参水溶性成分。

2.2 大孔树脂纯化工艺参数考察与优化

2.2.1 大孔树脂的预处理与再生

预处理：将大孔树脂用95%乙醇浸泡24小时，再用95%乙醇洗至与水(1：2)混合不产生浑浊，用水漂洗除去杂质并洗至无醇味，以水湿法装柱，用大量的蒸馏水冲洗后备用。

强化再生：使用过的树脂先用95%乙醇洗至流出液无色，用水洗至无醇味，再加入高于树脂层10CM的3%～5%盐酸溶液浸泡2-4小时，然后进行淋洗通柱继用3～4倍树脂体积同浓度的盐酸溶液通柱，然后用净水洗至接近中性；再用3%～5%的氢氧化钠溶液浸泡4小时。最后淋洗通柱，用同浓度的3～4倍树脂体积的氢氧化钠溶液通柱，最后用净水清洗至pH值为中性，备用。

2.2.2 树脂筛选

将0.5g生药/mL(丹酚酸B的浓度为10.88mg/mL)样品液分别通过3种不同型号的已预处理好的树脂柱，进行动态吸附。用三氯化铁试剂检查流出液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，计算总酚酸吸附量。树脂柱用水洗脱至洗脱液近无色，再用95%乙醇洗脱至洗脱液无色，测定洗脱液中丹酚酸B含量，将乙醇洗脱液蒸干，称重，计算回收率。结果见表2。

表2 树脂筛选结果

注：吸附量为单位干树脂吸附的总量，单位g/g或mg/g。下同。

由表2可知，在筛选的3种不同极性的大孔树脂中，用弱极性的AB-8树脂分离纯化丹参酚酸B的效能明显优于其它2种树脂，故选用AB-8树脂纯化丹参水溶性成分丹参酚酸。

2.2.3 上样浓度的确定

将不同浓度样品液分别通过AB-8树脂柱(20g干树脂)进行动态吸附。用三氯化铁试剂检查流出液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，计算总酚酸吸附量。结果见表3。从表3可知，上样浓度以0.5g生药/mL(丹酚酸B的浓度为10.88mg/mL)为宜。

表3 上样浓度确定

2.2.4 吸附流速确定

将浓度为0.5g生药/mL的样品液通过AB-8树脂柱(20g干树脂)，分别以1、2和3mL/min的流速进行动态吸附。用三氯化铁试剂检查流出液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，计算总酚酸吸附量。结果见表4。从表4可知，吸附流速以1mL/min为宜。

表4 吸附流速确定

2.2.5 泄漏曲线考察

按上述所确定的吸附条件，取样品液通过AB-8树脂柱(36g干树脂)，进行动态吸附，弃去前10mL流出液后开始分段收集。每10mL收集1份，共收集11份。每份流出液精密吸取1mL，加蒸馏水稀释至50mL，测定丹酚酸B的含量。结果见表5。据此绘制泄漏曲线(图1)。

表5 泄漏曲线考察结果

图1 泄漏曲线

从测定结果和泄漏曲线可知，第5份丹酚酸B浓度开始急剧增大，说明此时丹酚酸开始泄漏，故确定样品液最大上柱体积为60mL，计算丹酚酸B最大吸附量为18.65mg/g，相当于0.83g生药材/g干树脂。

2.2.6 洗脱溶媒的选择

按上述所确定的吸附条件，取样品液(0.5g生药/mL)30mL上AB-8大孔树脂柱(30g干树脂)，依次用蒸馏水200mL，10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇各100 mL梯度洗脱，蒸馏水洗脱液收集50mL4份，10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脱液分别收集50mL 4份。测定丹酚酸B含量，以瓶号和丹酚酸B含量为坐标绘制洗脱曲线，见图2。

1-4号水洗脱液；5-8号10%乙醇洗脱液；9-12号20%乙醇洗脱液；13-16号30%乙醇洗脱液；17-20号50%乙醇洗脱液；21-24号70%乙醇洗脱液；25-28号95%乙醇洗脱液 图2 丹酚酸B大孔树脂吸附梯度洗脱曲线图

梯度洗脱曲线显示：丹酚酸B主要集中在30%乙醇以前的洗脱液中，其中10%，20%和30%的洗脱液中丹酚酸B总量占全部醇洗脱的88.7%，而三者当中30%乙醇洗脱的解吸速度最快，故选用30%乙醇作为洗脱溶媒。

2.2.7 洗脱流速确定

按上述所确定的吸附条件进行动态吸附后，AB-8大孔树脂柱(30g干树脂)先分别用水洗脱至洗脱液近无色，再以50%乙醇为洗脱剂，分别以1、2和3mg/mL的流速进行洗脱。分别测定乙醇洗脱物中丹酚酸B含量。结果见表6。从表6可知，洗脱流速以1mL/min为宜。

2.2.8 洗脱曲线考察

按上述所确定的吸附和洗脱条件，取样品液50mL(0.5g生药/mL)进行上柱(30g干树脂)、吸附和洗脱，分段收集洗脱液。收集水洗脱液2份，每份为125mL，30%乙醇洗脱液13份，每份25mL，共收集15份。分别测定丹酚酸B含量，结果见表7。据此绘制洗脱曲线，见图3。

从表7及洗脱曲线可知，第12份洗脱液的含量已明显降低，故确定洗脱剂用量为10倍药材量。

2.2.9 验证试验

按确定的上述工艺条件，做3次重复试验，结果见表8。

表8 重复性试验结果

由以上重复性实验可知，该大孔树脂的除杂工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 实验中常用水提法提取丹参中总酚酸，水提取液中杂质较多，如无机盐、蛋白质、糖、鞣质等，使得到的水提取液中丹参总酚酸的浓度较低。为了提高提取液中酚酸类物质的浓度，常采用醇提水沉淀法、吸附澄清法、高速离心法、超滤法等方法进行分离纯化处理。但这些操作往往具有有效成份损失较高、生产周期长、分离处理成本高等缺点。大孔吸附树脂具有吸附量大、解吸和再生容易等优点，现广泛应用于中药行业中，本文试验结果表明，其可用于丹参总酚酸的分离纯化。

3.2 树脂洗脱试验中，常用的洗脱剂有乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，为减少对产品刺激性的影响及保护环境，本实验选用乙醇作为洗脱剂，丹参总酚酸主要集中在30%乙醇洗脱液中，50%洗脱液中虽然有一定量，但总酚酸的含量明显偏低，而70%～90%洗脱液中几乎不含丹参总酚酸，由此可预测，乙醇的洗脱浓度范围应在30%～50%范围内，进而采用动态洗脱方法，确定了乙醇的最佳浓度。

[1]高霞，王著明，等.不同水提醇沉法纯化丹参总酚酸工艺的比较[J].吉林医学，2009，30(7)：614.

[2]戈升荣，俞一心，谢更新.丹酚酸的药理作用研究进展[J].中药材，2002，25(9)：683-685.

[3]邓惠英.丹参及其有效成分的药理研究概况[J].现代医药卫生，2007，23(12)：1812.

[4]王雨华，周学谦.丹参多酚酸类分析方法及制备工艺的研究进展[J].药物评价研究，2017，7(40)：1012.

[5]杨小宁，唐星.丹参中总酚酸的分离纯化工艺研究[J].中草药，2007，6(38)：843.