富氢盐水对蛛网膜下腔出血大鼠神经保护作用的机制研究

涂盛 邵安文 盛吉芳

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）主要由动脉瘤破裂引起，约占脑卒中的9%[1]。长期以来，脑血管痉挛被认为是SAH预后不良的重要危险因素，许多临床及动物研究期望通过抑制血管痉挛从而阻止继发性脑损伤的发生[2-3]。后来，实验研究表明脑血管痉挛与SAH预后之间未见显著相关性[4]。学者们猜测可能存在其他机制参与SAH后的病理进程。近年来实验研究证实，早期脑损伤（即在SAH 72h内发生急性脑损伤）的病理、生理过程对SAH预后的影响较大，其中神经细胞凋亡是关键因素之一[5]。相关研究表明减少细胞凋亡可明显改善神经功能，提示这可能是治疗SAH的一个重要作用靶点[6-8]。氧化应激在SAH后早期脑损伤引起的神经细胞凋亡中发挥着重要作用，伴随而来的是活性氧（ROS）水平升高和抗氧化系统受损[9-10]。各项动物实验及临床研究表明，抗氧化治疗可以有效减轻实验动物及临床患者的神经功能损伤，部分原因归功于上述治疗的抗凋亡效应[6，8，11]。因此，探索潜在的抗氧化药物可能是未来SAH治疗的重要方向。氢气是一种安全、高效的抗氧化剂，能够有选择性地清除最强效的ROS（ONOO-和·OH）。关于氢气的神经保护作用，目前已在神经退行性疾病、脑缺血、脑出血、创伤性脑损伤等神经系统疾病中进行研究[12-13]。本团队前期研究也证实氢气对SAH后迟发性血管痉挛和早期脑损伤具有改善作用[14-16]；其他研究者也证实，氢气可通过抑制神经细胞凋亡、减轻炎症反应和脑水肿从而改善早期脑损伤，最终减轻神经功能损伤[17-19]。JAK家族的细胞质酪氨酸激酶传统上认为与细胞因子受体结合，有4个家族成员 （JAK1、JAK2、JAK3、TYK2）[20]。一旦激活，JAK酪氨酸磷酸化并激活其他信号分子，包括转录因子（STAT）[21]。因此，JAK是细胞表面受体与导致细胞生长的核转录事件之间的重要联系。相关研究表明，SAH发生后基底动脉壁中JAK2水平明显增加[22-23]。Osuka等[24]提出SAH能引起脑脊液促炎因子IL-6的产生，并诱导基底动脉中的JAK1磷酸化。然而，目前尚无研究探讨JAK2激活在SAH后早期脑损伤中的作用。因此，笔者对SAH大鼠腹腔注射富氢盐水，评估JAK2活化在SAH后的改变，以明确其神经保护作用的机制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）实验动物：将69只成年雄性SD大鼠（购自浙江中医药大学动物中心，体重280～320g）随机分为假手术组18只、0.9%氯化钠溶液（生理盐水）组26只、富氢盐水组25只，由于造模后死亡或SAH评分＜8分剔除大鼠15只，最终假手术组、生理盐水组、富氢盐水组各18只。实验前用标准饲料喂养，生长环境的温度维持在25℃左右。（2）富氢盐水：在高压（0.4MPa）环境下，将氢气溶解于0.9%氯化钠溶液中，使用一种产氢装置（中国上海第二军事医科大学提供）达到过饱和的水平。富氢盐水每周制备1次，以确保浓度＞0.6mmol/L[15]。

1.2 造模及给药方法 （1）本实验造模方法参考相关文献并作适当修改，通过血管内穿刺法建立SAH模型[7]。生理盐水组、富氢盐水组大鼠按400mg/kg经腹腔内注射水合氯醛进行麻醉，在实验中根据情况适时注射水合氯醛维持麻醉。使用加热垫使大鼠体温维持在37℃左右。经大鼠颈部皮肤中线切口，暴露左颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎并离断左颈外动脉，用血管剪剪开约3mm小口，使用4-0尼龙线插入小口并刺破大脑前动脉与大脑中动脉的分叉，从而完成SAH模型的制作。假手术组大鼠除了最后不刺破分叉外，其余过程与上述相同。（2）给药方法：假手术组不给药；富氢盐水组造模后立即按5ml/kg经腹腔注射富氢盐水，8h后再注射1次[15-16]；生理盐水组也在造模后立即腹腔注射等量的0.9%氯化钠溶液，8h后再注射1次。

1.3 评估指标 造模后24h进行神经功能评分，然后处死所有大鼠，进行SAH评分。每组6只大鼠进行脑组织水含量测定；每组6只大鼠用多聚甲醛水溶液灌注后，取脑组织进行TUNEL染色；每组6只大鼠大脑取出后冷冻在液氮中，进行Western blot检测。（1）神经功能评分：造模后24h，由2位不知晓动物分组的研究人员在相应时间点对大鼠进行改良的Garcia评分[25]，评分内容包括自发性活动、四肢运动对称、前肢的伸展情况、金属网状壁上攀登、双侧躯干的触碰反应和触须反应等6项，其中前 3 项 0～3 分/项，后 3 项 1～3 分/项，评分范围3～18分。评分越低表示神经功能损伤越严重。（2）SAH评分：根据Sugawara等[26]提出的方法进行SAH评分，将大脑基底分为6个部分，按每个部分的出血量进行1～3分的评分：无出血为0分，极少量出血为1分，中等量的血凝块且可分辨出血管为2分，大量出血且血凝块覆盖脑血管为3分。6个部分的分数相加，评分范围0～18分。（3）脑组织含水量：将全脑分为左大脑半球、右大脑半球、小脑、脑干等4个部分，用电子分析天平（精确到0.lmg）测量脑组织湿重，放入电热恒温鼓风干燥箱（100℃）烘烤72h至恒重，测干重（两次称重误差＜0.1mg），用干湿重法计算脑组织含水量，脑组织含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100.00%。（4）ROS、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平：取新鲜脑组织裂解、匀浆、离心、蛋白定量，ROS水平的检测选用目前最常用的细胞内ROS检测探针DCF-DA，混合液的荧光强度由荧光酶标仪来测定，最终ROS测定结果以荧光强度/毫克蛋白（mg prot）表示。按操作说明书检测 MDA（nmol/mg prot）、SOD（U/mg prot）、GSH-Px（U/mg prot）水平，与 ROS 检测方法类似。（5）凋亡神经细胞计数：采用TUNEL染色法。将冷冻切片加入0.3%Trixon-100进行通透处理，用5%羊血清进行封闭，加入TUNEL反应混合液（TdT+荧光素标记的dUTP液），加盖玻片在暗湿盒中反应。随后分别加入converter-POD和DAB底物，封片后在激光共聚焦显微镜下观察TUNEL染色阳性的细胞数，即凋亡神经细胞计数。（6） 磷酸化的 JAK2（pJAK2）、总 JAK2（tJAK2）、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平：采用 Western blot法。在预定时间处死大鼠，取穿刺侧大脑半球脑组织，提取蛋白，测定蛋白浓度，上样电泳，转膜，封闭，孵育一抗、二抗，曝光显影。本实验用于测定pJAK2、tJAK2、Bax和Caspase-3的蛋白表达水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。3组大鼠死亡率比较采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠死亡率、神经功能评分、SAH评分及脑组织含水量比较 3组大鼠死亡率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比较，生理盐水组神经功能评分降低（P＜0.05）；与生理盐水组比较，富氢盐水组明显升高（P＜0.05）。SAH发生24h后，蛛网膜下腔血凝块主要分布在Willis环和脑干腹侧周围；3组大鼠SAH评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比较，生理盐水组脑组织含水量明显升高（P＜0.05）；与生理盐水组比较，富氢盐水组明显降低（P＜0.05），见图 1。

图1 3组大鼠死亡率、神经功能评分、SAH评分及脑组织含水量比较（与假手术组比较，*P＜0.05；与生理盐水组比较，△P＜0.05）

2.2 3组大鼠ROS、MDA、SOD、GSH-Px水平比较 与假手术组比较，生理盐水组ROS、MDA水平均明显升高（均P＜0.05），SOD、GSH-Px水平均明显下降（均P＜0.05）。与生理盐水组比较，富氢盐水组ROS、MDA水平均明显下调（均P＜0.05），SOD、GSH-Px水平均明显上调（均P＜0.05），见图2。

图2 3组大鼠 ROS、MDA、SOD、GSH-Px水平比较（与假手术组比较，*P＜0.05；与生理盐水组比较，△P＜0.05）

2.3 3组大鼠凋亡神经细胞计数比较 假手术组几乎没有发现凋亡神经细胞。与假手术组比较，生理盐水组凋亡神经细胞计数明显增加。与生理盐水组比较，富氢盐水组凋亡神经细胞计数明显减少，见图3（插页）。

2.4 3 组大鼠 pJAK2、tJAK2、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平比较 3组大鼠tJAK2蛋白表达水平相近；与假手术组比较，生理盐水组、富氢盐水组pJAK2/tJAK2均较高（P＜0.05）；与生理盐水组比较，富氢盐水组pJAK2/tJAK2降低（P＜0.05），这表明富氢盐水可以抑制JAK2的激活及磷酸化。与假手术组比较，生理盐水组、富氢盐水组Bax、Caspase-3蛋白表达水平均较高（P＜0.05）；与生理盐水组比较，富氢盐水组Bax、Caspase-3蛋白表达水平均降低（P＜0.05），见图 4。

3 讨论

本研究主要探讨富氢盐水对大鼠SAH后神经保护作用的机制。首先，使用血管内穿刺法建立的SAH模型会引起细胞（尤其是神经元）凋亡，给予富氢盐水治疗后可以减少凋亡神经细胞数量，减轻神经损伤。此外，注射富氢盐水会引起SOD、GSH-Px水平升高，ROS、MDA水平下降；还能抑制JAK2的激活，降低Bax、Caspase-3蛋白表达水平。

既往研究表明，SAH引起的线粒体功能障碍将会导致氧化应激的发生，在早期脑损伤中发挥着关键作用[27-28]。而氧化应激通常与高反应性自由基相关，包括ROS和活性氮（RNS），·OH和ONOO-是其中活性最强的[12]。相关研究证明，硝基酪氨酸、MDA和8-OHG分别作为蛋白质、液体和DNA氧化的主要标记物，其含量会在SAH发生后明显增加[17-18，29]。以往研究表明，SAH后氧化应激的发生主要是由蛛网膜下腔血块红细胞中的氧合Hb引起的[30]；且氧化应激多发生在神经元中，与SAH后神经细胞凋亡密切相关[31]。因此，抑制氧化应激诱发的神经细胞凋亡是SAH的重要治疗策略[32-34]。作为一种新型抗氧化剂，氢气可以有选择性地清除·OH和ONOO-[12]，可在动物和临床研究中被用于各种疾病的治疗。近年来，氢气被用于包括SAH在内的多种神经系统疾病的治疗研究。既往研究表明使用氢气治疗SAH的效果良好。而本研究结果亦表明富氢盐水减少了神经细胞凋亡，改善了神经功能损伤。

图 4 3 组大鼠 pJAK2、tJAK2、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平比较 （a：pJAK2、tJAK2、Bax、Caspase-3 蛋白表达的电泳图；b：3 组大鼠pJAK2/tJAK2比较；c：3组大鼠Bax蛋白表达水平比较；d：3组大鼠Caspase-3蛋白表达水平比较；与假手术组比较，*P＜0.05；与生理盐水组比较，△P＜0.05）

如今越来越多的证据表明，JAK2在神经系统疾病的发病机制中具有关键作用，如阿尔茨海默病、脊髓损伤、脑缺血和SAH等[23,35-37]。目前已发现的4个JAK在细胞表面到细胞核的信号转导中发挥着重要作用。JAK1、JAK2是成熟神经系统中主要的JAK成员，而JAK3、TYK2的表达量较低[38]。本研究结果发现，SAH模型建立后JAK2被激活，而富氢盐水能够抑制JAK2的激活并改善神经功能损伤。既往研究表明，SAH后JAK2表达水平升高，与基底动脉内皮细胞凋亡相关[23]。Jiang等[39]发现注射JAK2抑制剂AG-490会增加凋亡神经细胞计数，且Bax、Caspase-3表达水平均明显升高。本研究结果表明，注射富氢盐水可增强JAK2的磷酸化，抑制JAK2的激活，下调Bax、Caspase-3的蛋白表达，从而抑制氧化应激的发生，减少SAH后神经细胞凋亡的发生；提示富氢盐水通过调节JAK2信号通路从而在SAH中发挥抗凋亡效应。

综上所述，富氢盐水可以减轻SAH后的早期脑损伤，改善SAH后的神经功能损伤，其作用机制部分通过抑制JAK2的激活实现。但本项研究存在一定的局限性：（1）只分析了大脑皮层，而氢气抑制JAK2的激活应当在其他大脑区域如海马体中进行验证；（2）只研究了1种剂量和1个时间点。将来研究会在富氢盐水多种剂量、多个治疗时间点进行展开。

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