重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的优化表达及疫苗活性研究

王斌，罗时渝，谢景毅，叶燕锐，潘力

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）

断奶猪多系统衰竭综合症(Post-weaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)，俗称猪蓝耳病，是一种影响养猪业发展的重要传染病，该病传播范围广泛、致死率较高、难以治愈，已在世界范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是猪蓝耳病的主要致病原[1]，PCV2通过侵入猪的淋巴组织抑制其免疫系统，引发猪圆环病毒以及其相关疾病如猪皮炎、肾病综合征（PDNS）等[2,3]。猪圆环病毒2型具有2个主要的开放阅读框（ORF）。衣壳蛋白（Cap）作为 PCV2病毒重要的结构和功能蛋白，由PCV2基因的ORF2编码合成[4,5]。目前已经商业化的PCV2疫苗基本是以Cap蛋白为靶蛋白研制的，主要包括病毒灭活疫苗和杆状病毒表达的亚单位疫苗[6]，但杆状病毒表达系统的生产工艺复杂，生产成本较高，不能广泛应用于工业生产。

本试验以酵母密码子偏好性优化的PCV2-Cap基因为模板，pPICZαA为表达载体，利用AOX1启动子来诱导高水平表达。通过毕赤酵母表达系统表达去除核定位信号序列的 Cap基因，并高密度发酵得到PCV2-Cap蛋白，使用SDS-PAGE和Western Blot技术对表达的重组蛋白进行检测，结果表明猪圆环病毒2型Cap蛋白在X-33毕赤酵母中成功表达。随后对猪圆环病毒2型Cap蛋白的毕赤酵母表达菌株5 L发酵罐发酵小试，将发酵产物纯化后的产物制备成免疫抗原进行动物免疫实验研究，发现所得PCV2-Cap蛋白可作为疫苗用于猪 PMWS病的免疫预防。目前PCV2-Cap的表达研究中，大肠杆菌和酵母系统是使用最广泛的两种表达系统，异源表达的PCV2-Cap蛋白有研制成疫苗和诊断性试剂的潜力[7,8]。本试验在毕赤酵母重组表达的基础上研究了疫苗活性，为开发重组PCV2-Cap亚单位疫苗提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌种

pPICZαA载体、毕赤酵母P. pastorisX-33菌株均购自美国Invitrogen公司；PUC57-Cap-opt载体（含酵母密码子偏好性优化的PCV2-Cap基因）由本南京金斯瑞公司合成；猪圆环病毒Cap蛋白质抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自博奥森生物公司。

1.2 实验试剂

ZeocinTM抗性、限制性内切酶EcoRI、SalI和SacI均购自美国Thermo Fisher公司；DNA Ladder Marker、Protein Ladder、PrimeSTAR DNA聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit购自美国NEB公司；油乳佐剂ISA206购自法国Seppic公司；猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒、猪圆环病毒2型灭活疫苗（WH株）均购自武汉科前生物公司。

1.3 引物设计

根据PUC57-Cap-opt载体中优化后的PCV2-Cap基因序列设计引物（见表 1）。引物EcoRI-dcap-F/SalI-dcap-R用于扩增去除核定位信号的PCV2-Cap基因，在上游引物的5’端引入EcoRI酶切位点，下游引物的 5’端引入 SalI酶切位点。引物5’AOX/3’AOX 为通用测序引物。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 重组表达载体的构建

将PCV2-Cap基因的PCR产物与pPICZa A载体质粒分别采用EcoRI/SalI进行双酶切，连接DNA片段与线性化载体，转化大肠杆菌感受态细胞，经Zeocin抗性筛选，通过菌液PCR验证阳性克隆，得到猪圆环病毒2型Cap蛋白真核表达载体。送样至Invitrogen公司测序，将构建正确的重组表达载体命名为pPICZαA-Cap-opt(ΔNLS)，使用SacI单酶切线性化。

1.5 重组酵母表达菌株的构建

将 10 μg 线性化质粒 pPICZαA-Cap-opt(ΔNLS)与80 μL毕赤酵母宿主菌感受态细胞混合均匀后电转化，工作参数为1500 V，5 ms。电击完毕后迅速加入1 mL冰预冷的1 M山梨醇溶液。涂布于YPDZ平板（100 μg/mL Zeocin）上 30 ℃恒温培养。再以EcoRI-dcap-F/SalI-dcap-R为验证引物，进行PCR鉴定毕赤酵母转化子，检测PCV2-Cap基因是否整合入酵母菌株基因组中，得到重组菌株P. pastorisX-33(pPICZαA-Cap-opt)。

1.6 重组酵母表达菌株的甲醇诱导

将重组酵母表达菌株接种于25 mL BMGY培养基中，30 ℃，200 r/min 培养16～20 h，2000 g 离心5 min收集菌体，转接到 5 mL BMMY培养基中，稀释到OD600=1，30 ℃，200 r/min继续培养96 h。每隔24 h加入1%的甲醇进行诱导。按24 h间隔分别取样，8000 g离心，收集上清液。

1.7 PCV2-Cap蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析

将上述诱导表达的上清液分别取样，按常规方法进行 SDS-PAGE检测｡并将相应的样品电转印至PVDF膜，用1% BSA-TBS溶液封闭1 h，TBST溶液清洗，用猪圆环病毒Cap蛋白质抗体温育1 h，TBST溶液清洗，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG-HRP温育2 h，再次用TBST溶液洗涤，加入适量BeyoECL Plus化学发光液显色反应，最后将PVDF膜放置到荧光成像仪中曝光｡

1.8 PCV2-Cap蛋白真核表达的发酵小试

将构建的重组菌株P. pastorisX-33(pPICZαA-Cap-opt)进行5 L发酵罐的发酵小试。将活化的重组表达菌株种子液接种10%到2 L YPD培养基中，30 ℃，用氨水调节pH=5.5，搅拌转速800 r/min进行批式发酵。变速流加50%甘油分批补料发酵，碳源饥饿处理30 min后进行甲醇补料培养，总发酵时间120 h左右，8000 g离心并保存发酵液上清。

1.9 动物免疫试验

取上述发酵上清进行His亲和层析纯化后加入等体积的油乳佐剂ISA206制备成免疫抗原样品｡将9头PCV2阴性的仔猪（21～28日龄）随机分为3组，试验组用2 mL免疫抗原进行颈部肌肉注射，阳性组用猪圆环病毒2型灭活疫苗注射作为对照，阴性组用相同体积的PBS溶液注射作为对照，首免2周后采用相同的剂量进行二免。按照首免后14、27、40 d的顺序进行仔猪的采血操作，无菌分离血清后，用猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒测定抗体水平｡S/P值大于0.16结果判定为阳性，S/P值小于0.16结果判定阴性。

2 结果与讨论

2.1 重组表达载体的PCR验证

构建的PCV2-Cap蛋白真核表达载体质粒全长为4069 bp，随机挑取Zeocin抗性LLB培养基中获得的重组表达载体质粒的转化子，使用EcoRI-dcap-F/SalI-dcap-R这一对引物进行 PCR验证筛选阳性克隆，扩增的PCR产物长度为608 bp，琼脂糖凝胶电泳验证结果如图1所示，挑取的大肠杆菌转化子全部为阳性。选取菌液PCR验证正确的菌株送样至 Invitrogen公司测序，确定构建正确的 PCV2-Cap蛋白表达载体菌株。

图1 pPICZα A-Cap-opt(ΔNLS)载体转化子的PCR鉴定Fig.1 PCR identification of pPICZα A-Cap-opt(ΔNLS) vector transformant

2.2 重组酵母表达菌株的筛选

图2 pPICZα A-Cap-opt(ΔNLS)毕赤酵母转化子菌落PCR鉴定Fig.2 PCR identification of pPICZα A-Cap-opt (ΔNLS) Pichia pastoris transformant

随机挑取 6个毕赤酵母重组转化子，使用EcoRI-dcap-F/SalI-dcap-R这一对引物直接 PCR验证毕赤酵母电转化表达的重组子，琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果如图2所示，以重组转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果为阳性，表明PCV2-Cap基因成功整合到宿主的基因组上，重组酵母表达菌株中含有目的基因。

2.3 毕赤酵母表达 PCV2-Cap蛋白的SDS-PAGE检测

将毕赤酵母表达菌株P. pastorisX-33(pPICZαA-Cap-opt)与毕赤酵母宿主菌株X-33分别接种培养，进行甲醇诱导表达。将诱导表达的上清液进行SDS-PAGE检测分析。鉴定结果如图3所示，PCV2-Cap基因在毕赤酵母中表达的蛋白大小约为26 ku，与设计的蛋白大小一致，从甲醇诱导的48 h左右开始积累分泌蛋白，且胞外的上清蛋白中含有较少的杂蛋白。

图3 SDS-PAGE检测甲醇诱导猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的表达Fig.3 Expression of PCV2-Cap protein induced by methanol inP. pastoris by SDS-PAGE

2.4 毕赤酵母表达PCV2-Cap蛋白的Western blot检测

以猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒中提供的抗原PCV2-Cap蛋白作为对照，将上述蛋白样品进行Western blot鉴定。结果与SDS-PAGE检测的结果一致，宿主菌株 X-33在没有表达相应的蛋白，毕赤酵母表达菌株P. pastorisX-33(pPICZαA-Cap-opt)诱导表达的分泌蛋白与一抗Rabbit Anti-PCV2 Cap蛋白的免疫反应呈阳性，如图4所示。结果说明PCV2-Cap基因在毕赤酵母宿主菌X-33中实现了分泌表达。

图4 Western blot检测甲醇诱导猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的表达Fig.4 Expression of PCV2-Cap protein induced by methanol inP. pastoris by western blot

2.5 动物免疫试验

图5 动物免疫试验抗体变化趋势图Fig.5 Trend chart of antibody change by animal immunization test

高密度发酵得到PCV2-Cap蛋白在发酵上清液中的浓度约为0.53 mg/mL，占总蛋白定量比例的23.5%。重组蛋白表达量高于 Tu等[8]在毕赤酵母系统表达的摇瓶发酵产量0.17 mg/mL。在动物免疫试验挑选试验猪体阶段，由于难以找到符合试验条件的抗体阴性仔猪，故选取Elisa检测S/P值接近的9头23日龄保育猪，随机分为3组进行动物免疫试验研究。如图5所示，以免疫时间为横坐标，样品血清的S/P值为纵坐标，比较各组抗体检测结果的变化趋势。试验组与阳性组总抗体水平基本类似，整体抗体水平呈上升趋势，S/P值的平均值比较接近，Elisa检测结果为阳性，符合疫苗免疫后的抗体产生规律。阴性组抗体S/P值表现为下降，尤其在第二次免疫后下降趋势明显，二免后26 d降到阴性值以下，符合母源抗体逐渐消减的规律。

3 结论

3.1 Cap蛋白N端l～41个氨基酸序列中含有丰富的精氨酸（Arg），疏水性较强。这段保守序列是Cap蛋白的核定位信号（NLS）[9]，不参与形成抗原表位，影响Cap蛋白的识别、运输到细胞核内的过程，全长的PCV2-Cap基因很难在异源表达系统中表达[10,11]。

3.2 酵母是在科学研究和工业应用领域最常使用的真核表达系统之一，毕赤酵母表达系统可以进行糖基化、折叠等翻译后修饰，对异源蛋白的分泌表达有很大优势[12,13]。本研究构建了包含去除核定位信号的PCV2-Cap基因的重组酵母表达菌株，Cap蛋白经甲醇诱导，在毕赤酵母表达系统中实现了分泌表达。SDS-PAGE和 Western blot结果显示，重组表达的PCV2-Cap蛋白大小为26 ku，具有良好的免疫抗原性，且证明了核定位信号的缺失不影响PCV2-Cap基因的免疫性能。动物体内免疫实验对重组PCV2-Cap蛋白在仔猪体内的生物安全性和免疫性能做了初步的研究，结果表明重组PCV2-Cap蛋白具有良好的免疫原性，可以刺激机体产生相应的抗体，且与商业化的猪圆环病毒疫苗的抗体产生规律类似，对比无显著性差异。

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