不同茶类陈年茶的生化成分分析及其抗氧化活性

向丽敏，刘雅琼，赖幸菲，黎秋华，孙伶俐，陈文品，陈栋，孙世利

（1.广东省农业科学院茶叶研究所，广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东广州 510640）（2.华南农业大学园艺学院，广东广州 510642）（3.广东省供销合作联社，广东广州 510080）

茶叶是以山茶科植物茶(Camellia sinensis(L)O.Kuntze)的芽、叶为原料的制成品，被誉为世界三大无酒精饮料之一，在我国有着悠久的茶叶历史。因其含有丰富的茶多酚、茶多糖、维生素及矿物质等营养物质[1]，茶具有兴奋、醒酒、利尿、助消化、抗衰老、抗癌变、杀菌和解毒等功效[2～7]。根据制作工艺及外形色泽的不同将茶叶分为绿茶、红茶、黄茶、青茶、黑茶和白茶六大茶类[8]。

近年来，国内外茶叶市场上因对普洱茶有“越陈越香”的推崇，让很多消费者开始了对陈年茶的追捧。继普洱茶等黑茶之后，红茶、白茶、绿茶、黄茶和青茶类的陈年茶也逐步走入大众视野。在粤港澳等地民间历来流传着陈年茶有解暑、去毒和清积止泻等药效，素有“一年茶，三年药，七年宝”之说[9,10]。在广东、福建和台湾等地，也有贮存和饮用陈年茶的传统[11]。

茶叶经过长期陈放，其内含物质如茶多酚、氨基酸、糖类、生物碱及芳香物质会发生一系列复杂的生物化学和热化学反应，因而直接表现在色、香、味的变化上，其营养价值和保健作用也发生了相应的变化[12～15]。陈年茶随着贮藏时间的增加，茶叶颜色变深，茶梗颜色转红褐色、叶底越来越乌黑油润和柔软，但冲泡时叶底仍可自然开展，茶汤色泽越来越深红透亮，越偏红褐色，茶汤风味从新鲜的茶香，渐次产生醇厚陈年茶韵味[16]。实验针对不同茶类 11个陈年茶样品，采用紫外分光光度法和高效液相色谱法，测定了其主要生化成分及儿茶素组分和咖啡碱含量，同时采用FRAP法测定了这些茶样的总抗氧化能力。本研究旨在探索这些陈年茶生化成分的质量分数及抗氧化活性的差异，以期为陈年茶的进一步开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：岭头单丛冰红（广东省饶平县，陈放5年红茶）、老挝产野生老树红茶（老挝，陈放 5年红茶）、大理种古树红茶（云南省昌宁县，陈放5年红茶）、千家寨生普散茶（云南省镇沅县，陈放10年黑茶）、滇茯香生普砖茶（云南省云县，陈放 10年黑茶）、滇药香熟普砖茶（云南省云县，陈放 10年黑茶）、广东陈香茶（广东省韶关市，广云贡原料，陈放20年黑茶）、茂芝观音（广东省饶平县，陈放20年乌龙茶）、黄金桂（广东省饶平县，陈放20年乌龙茶）、大叶奇兰（广东省饶平县，陈放20年乌龙茶）、岭头单丛（广东省饶平县，陈放20年乌龙茶）。各干茶样经过粉碎，过40目筛。

标准品：没食子酸（GA）、咖啡碱（CA）、儿茶素（C）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、没食子酸儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）均购自上海源叶生物技术有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器

1200型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；HHS型恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；721N紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；BS110s电子分析天平，德国Sartorius仪器公司；ZMQS5001型Millipore纯水仪，美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 茶叶生化成分含量检测

水分测定：GB/T 8304-2013；水浸出物测定：GB/T 8305-2013；茶多酚含量测定：GB/T 8313-2008；氨基酸含量测定：水合茚三酮比色法GB/T 8314-2013；可溶性糖含量测定：蒽酮-硫酸比色法[17]；黄酮类化合物总量测定参照三氯化铝比色法[17]；茶黄素、茶红素、茶褐素含量测定：系统比色法[17]。

1.3.2 茶多酚类成分与咖啡碱含量检测

1.3.2.1 茶汤浸提

称取0.2 g磨碎的茶样于10 mL离心管中，加入在70 ℃ 70%甲醇溶液5 mL，混匀后置于70 ℃水浴中浸提10 min（每隔5 min搅拌一次），浸提后冷却至室温，在3500 r/min转速下离心10 min，将上清液转移至10 mL容量瓶。残渣再用5 mL 70%甲醇溶液提取一次，重复以上操作。合并提取液定容至 10 mL，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，待用。

1.3.2.2 HPLC法检测茶多酚类成分及咖啡碱含量

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，150 mm×4.6 mm；检测波长280 nm，检测温度28 ℃；流动相A：含0.5%乙酸、1%乙腈和2%甲醇的水溶液；流动相B：含0.5%乙酸、10%乙腈和20%甲醇的水溶液。

洗脱步骤：在 0～30 min内，A 相由 72.5%到20%，B相由27.5%到80%，30 min后在5 min内，A相由20%恢复到72.5%，B相由80%恢复到27.5%，流速1.0 mL/min，进样量为10 μL，以外标法按峰面积进行定量。

1.3.3 茶叶的总抗氧化能力的检测

吸取上述1.3.2.1浸提的茶汤，用蒸馏水分别稀释配制梯度浓度为25、50、100、150、200、300 μg/mL的茶汤样品。在反应管中加入 100 μL的茶汤样品溶液，再加入3 mL FRAP工作液（由300 mmol/L醋酸盐缓冲液，10 mmol/L TPTZ溶液，20 mmol/L FeCl3溶液以10:1:1的比例组成，现配现用），再加入300 μL蒸馏水，混匀，37 ℃条件下反应20 min，于593 nm处测定其吸光值，每个实验重复三次。按照上述相同方法，以0.05～0.6 mmol/L的FeSO4的标准溶液代替样品绘制标准曲线，样品的抗氧化活性(FRAP值)以达到相同吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。

1.4 数据分析

实验处理重复3次，结果取平均值，各组实验数据测定值用平均数±标准差表示。运用SPSS 11.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 不同茶类陈年茶中主要生化成分比较

从表1可知，不同茶类陈年茶样中主要品质生化成分含量相差较大。茶叶中水浸出物是一切可溶性物质的总和，其中包括多酚类化合物、可溶性蛋白质、果胶、维生素群、糖类、生物碱及微量的芳香油等，对茶叶的品质起决定性的作用[18]。陈年黑茶水浸出物含量普遍较低，陈年乌龙茶与陈年红茶水浸出物含量相当；水浸出物含量最高的是岭头单丛乌龙茶，为42.09%，其次是岭头单丛冰红，水浸出物含量最低的是滇药香熟普砖茶，仅为 11.52%，其中最高含量是最低含量的3.65倍。茶多酚与茶叶品质密切相关，是茶叶内含成分和功能性成分的主体，是茶叶滋味浓度和苦涩味的代表物质。茶多酚含量最高的是岭头单从乌龙茶，为 19.77%，最低的是滇药香熟普砖茶，仅为1.89%。

滇药香熟普砖茶茶多酚含量下降明显可能有以下几个方面原因：1.茶叶品种本身茶多酚含量低；2.在砖茶的渥堆发酵及长期存放过程中，儿茶素发生自动氧化反应；3.在砖茶的渥堆发酵过程中，微生物代谢产生各种酸性物质，使儿茶素处于不稳定环境，造成儿茶素降解；4.在酸性环境下酚类物质被微生物透膜吸收，或在酶的作用下酚类物质降解为可被微生物利用的碳源[18,19]。黄酮类含量范围为3.26%～6.48%，其中最高的是广东陈香茶，其次是滇茯香生普砖茶，最低的是千家寨生普散茶。11个陈年茶样可溶性糖含量范围为1.22%～4.43%，其中可溶性糖含量最高的是老挝野生老树红茶，最低是滇药香熟普砖茶。氨基酸含量范围为0.33%～5.62%。氨基酸含量最高的是老挝野生老树红茶，最低的是滇药香熟普砖茶。从茶色素的含量来看，11个陈年茶样中茶黄素含量最低，茶红素次之，茶褐素含量最高，茶黄素范围为0.09%～0.39%，茶红素范围为 2.55%～7.40%，茶褐素范围为3.85%～13.82%。

表1 11个陈年茶样中主要生化成分含量（%）Table 1 Contents of main biochemical components of 11 aged tea samples (%)

2.2 同一茶类陈年茶中主要生化成分比较

由表1知，同一茶类不同茶树品种或产地的陈年茶样中主要品质生化成分含量也有差别。3个不同产地及品种陈放5年的红茶样中，岭头单丛冰红中水浸出物含量、茶多酚含量、茶黄素以及茶红素含量高于其他种红茶；大理种古树红茶中黄酮类含量以及茶褐素含量高于其他红茶；老挝野生老树红茶中氨基酸与可溶性糖的含量高于其两种红茶。四个不同品种陈放20年的乌龙茶样中，陈年岭头单丛乌龙茶中水浸出物、茶多酚、氨基酸及茶红素的含量明显高于其它三个品种的陈年乌龙茶；黄酮类、可溶性糖及茶褐素含量以陈年茂芝观音含量最高；这四个品种陈年乌龙茶黄素含量相差不大。四个不同品种陈年黑茶样中，千家寨生普散茶中茶多酚含量、水浸出物含量、氨基酸含量、可溶性糖含量及茶红素含量均高于其他种黑茶样；广东陈香茶中黄酮与茶褐素含量高于其他种黑茶样；这四个品种陈年黑茶样中茶黄素含量相差不大。

2.3 不同茶类陈年茶中儿茶素组分及咖啡碱含量比较

儿茶素和咖啡碱是茶叶中的两个重要功能性成分。儿茶素是茶多酚的主体成分，其含量与茶叶品质及适制性有密切关系[20]。没食子酸(GA)是茶多酚的重要组成单元，常以酯的形式连接在儿茶素的酚羟基上，形成一系列的酯型儿茶素衍生物[21]。咖啡碱是茶叶苦味的主要呈味物质[22]。

从表2可知，不同茶类陈年茶样中部分儿茶素组分及咖啡碱含量相差较大。陈年红茶样、陈年乌龙茶样及陈年黑茶样中EGC均未检出；陈年红茶样中GC和CG未检出，且EGCG含量较低；陈年乌龙茶样中GC和EGCG含量显著高于其他茶类样品；陈年黑茶样中GA含量普遍较低。由于茶叶在发酵过程中，多酚类物质发生氧化、聚合，形成茶黄素和茶红素等成分，导致发酵度高的茶叶中儿茶素类成分含量相较于发酵度低茶叶有一定程度的降低。同时，酯型儿茶素尤其是EGCG在发酵过程中的降解，导致发酵度低的茶叶中该成分含量高于发酵度高的茶叶[23]。陈年黑茶样滇药香熟普砖茶和滇茯香生普砖茶中咖啡碱含量显著低于其他茶样。有研究表明，咖啡碱在茶叶中分为游离态和结合态存在，在黑茶的发酵过程中，游离态的咖啡碱含量逐渐降低；此外，随着陈化时间的延长，游离态咖啡碱含量下降[24]。

表2 11个陈年茶样中儿茶素组分及咖啡碱含量(%)Table 2 Contents of catechin and caffeine of 11 aged tea samples (%)

2.4 同一茶类不同品种陈年茶中儿茶素组分及咖啡碱含量比较

从表2可知，同一茶类陈年茶样中儿茶素组分及咖啡碱含量也有差异。3个不同产地不同品种陈放 5年的红茶样中，儿茶素单体、没食子酸和咖啡碱含量差异明显，以广东省饶平县产的岭头单丛冰红最高，显著高于其它两种陈年红茶，老挝产野生老树红茶次之，大理种古树红茶含量最低。4个不同品种陈年的乌龙茶样中，陈年岭头单丛乌龙茶中没食子酸、咖啡碱、部分儿茶素单体(CG、ECG、EGCG)、酯型儿茶素及儿茶素总含量明显高于其它三个品种的陈年乌龙茶，而其它三个品种陈年乌龙各成分含量相差不大。4个不同品种陈年的黑茶样中，没食子酸、儿茶素单体、酯型儿茶素、非酯型儿茶素及儿茶素总含量差异明显，千家寨生普散茶中没食子酸、儿茶素单体含量显著高于其他陈年黑茶样；广东陈香茶中咖啡碱含量显著高于其他陈年黑茶样；陈年滇药香熟普砖茶中仅检出没食子酸和咖啡碱，8种儿茶素单体成分均未检出。滇药香熟普砖茶未检出儿茶素单体成分，一方面可能是鲜叶中儿茶素的含量比较低所致，另一方面滇药香熟普砖茶经过较长时间的渥堆发酵和 10年仓储后，原有的儿茶素进一步大量转化降解，可能是其儿茶素均未检出的另一原因[25]。

2.5 不同茶类陈年茶总抗氧化能力比较

图1 三个陈年红茶样总抗氧化能力比较Fig.1 Comparation of total antioxidant ability of three different aged black tea samples

采用FRAP法测定了11个陈年茶样的抗氧化能力，结果如图1～3所示。结果表明在本研究浓度范围内，随着各茶样浓度的增加茶样提取液的抗氧化活性逐渐增强，呈现一定的量效关系。不同茶类陈年茶样总抗氧化能力相差较大。其中以陈年千家寨生普散茶和岭头单丛乌龙茶的抗氧化能力最强，黄金桂和岭头单丛冰红次之，大理古树种红茶、老挝野生老树红茶、大叶奇兰、茂芝观音、滇茯香生普砖茶及广东陈香茶这六个茶样抗氧化能力相当，滇药香熟普砖茶抗氧化活性最弱。茶叶的抗氧化活性受到许多因素的影响，不同的生化成分影响程度的研究尚不清楚。有研究表明茶叶中各个抗氧化物质间的协同作用影响着茶叶的抗氧化能力[26]。通过比较这些茶样的生化成分及儿茶素总量含量发现，千家寨生普散茶和岭头单丛乌龙茶的的茶多酚、儿茶素的含量均高于其它茶样，而滇药香熟普砖茶的茶多酚含量最低，且8种儿茶素单体成分均未检出。由此可见，茶样的抗氧化能力强弱与其茶多酚和儿茶素含量呈正相关关系。

图2 四个陈年乌龙茶样总抗氧化能力比较Fig.2 Comparation of total antioxidant ability of four different aged oolong tea samples

2.6 同一茶类不同品种陈年茶总抗氧化能力比较

图3 四个陈年黑茶样总抗氧化能力比较Fig.3 Comparation of total antioxidant ability of four different aged dark tea samples

由图1～3可知，同一茶类不同品种陈年茶的抗氧化能力也有差异。三个陈年红茶样中，岭头单丛冰红抗氧化活性最强，大理古树种红茶和老挝野生老树红茶抗氧化活性相当；四个陈年乌龙茶样中，岭头单丛乌龙茶抗氧化活性最强，黄金桂次之，大叶奇兰和茂芝观音抗氧化活性相当；四个陈年黑茶样抗氧化能力表现为千家寨生普散茶＞滇茯香生普砖茶＞广东陈香茶＞滇药香熟普砖茶，其中千家寨生普散茶抗氧化能力显著高于其它三个茶样，这与儿茶素总量含量高低趋势一致。

2.7 不同茶类陈年茶生化成分与总抗氧化能力灰色关联分析

茶叶的抗氧化活性受很多因素的影响，不同生化成分的影响程度尚不清楚，仍是一个灰色系统，故采用灰色关联分析法进行分析[26]。分析茶多酚类、黄酮类、可溶性糖、氨基酸、茶黄素、茶红素以及茶褐素对茶叶总抗氧化能力的影响，以200 μg/mL的茶汤的FRAP值为参考序列，其余生化成分成分含量为比较序列。通过计算关联系数来判断关联程度。计算得到了各个参考序列的关联系数：茶多酚类=0.5425；黄酮类=0.4685；可溶性糖=0.4699；氨基酸=0.3066；茶黄素=0.4645；茶红素=0.4259；茶褐素=0.3651。关联度排列顺序为：茶多酚类＞可溶性糖＞黄酮类＞茶黄素＞茶红素＞茶褐素＞氨基酸。上述关联度表明对茶叶总抗氧化能力影响最大的是茶多酚含量，其次是水浸出物含量，对抗氧化能力影响最弱的是氨基酸含量[27]。

3 结论

通过对三个不同茶类陈年茶品质进行生化成分和总抗氧化能力测定，结果表明不同茶类陈年茶样中主要品质生化成分含量、总抗氧化能力相差较大，同一茶类不同品种或产地的陈年茶样中主要品质生化成分含量及抗氧化能力也有差别。灰色关联分析法结果显示茶多酚类物质对各个茶样总抗氧化活性影响最大，氨基酸含量对各茶样抗氧化活性影响最小。并且各茶样抗氧化活性与各自的茶多酚和儿茶素总含量呈浓度依赖关系。本试验针对不同茶树品种或不同茶类陈年茶的生化成分及抗氧化活性进行比较研究，以期为陈年茶的进一步开发和利用提供理论依据。

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