气相色谱-串联质谱法同时测定食品中的氯丙醇酯和缩水甘油酯

刘青，阮君，曾广丰，张洋子，魏文心，王志元，陈文锐，康文昱

（1.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东广州 510623）（2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东广州 510623）（3.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（4.岛津企业管理（中国）有限公司广州分公司，广东广州 510010）

氯丙醇酯类化合物（MCPDE）是氯丙醇与脂肪酸的酯化产物，主要形成于食品加工尤其是油脂精炼过程中，因此在油脂类食品中污染水平较高，在精炼植物油、婴幼儿奶粉、焙烤食品和膨化食品中均有报道检出[1～5]。油脂中的缩水甘油酯（GE）与氯离子共存，在受热情况下也可形成氯丙醇酯，研究表明 MCPDE和GE能在人体小肠被分解转化为氯丙醇（MCPD），具有肾脏及生殖毒性和可能致癌等作用，因此近年来广受人们的关注[6～11]。氯丙醇酯类化合物包括 3-氯-1,2-丙二醇酯(3-MCPDE)、2-氯-1,3-丙二醇酯(2-MCPDE)以及双氯取代的 1,3-二氯-丙醇酯(1,3-DCPE)和2,3-二氯-丙醇酯(2,3-DCPE)，其中以 3-氯丙醇酯（3-MCPDE）的毒性最强，因此研究的人也最多。如何准确测定3-MCPDE、2-MCPDE和GE的含量对保障食品安全和人体健康具有重要意义。1995年，欧共体委员会食品科学分会对氯丙醇类物质的毒理做出评价，证实它具有致癌性，致突变性，肾脏毒性和生殖毒性作用。美国FDA建议食物所含3-MPCD的水平不应超过1 mg/kg干物质；2001年，FAO/WHO建议3-MPCD的最高日允许摄取量(PMTDI)为2 μg/kg体重。由于2-MCPD与3-MCPD的结构相似，所以这类氯丙醇酯引起的健康风险也不容忽视。

食品中的 MCPDE的检测多采用气相色谱法（GC）、气相色谱质谱法（GC-MS）和液相色谱质谱法（LC-MS）[12～22]。LC-MS法为直接法，前处理过程相对简单，但由于标准品种类繁多、会导致检测成本增加；GC-MS法是国际公认的检测方法，采用间接法，通过酯交换，衍生化后检测氯丙醇酯的总量。目前尚未有同时测定复杂食品基质中MCPDE和GE的标准方法，国际标准组织ISO和德国油脂协会DGF仅公布了油脂中3-MCPDE和GE测定的标准方法[23～25]，我国《食品安全国家标准食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的测定》（GB 5009.191-2016）仅限于食品中MCPDE的检测，均采用间接法[26]。由于采用GC-MS方法有时会出现成分复杂样品杂质干扰大的缺点，从而影响结果的准确性，而采用GC-MS/MS法多反应监测模式（MRM）检测，能够使目标物的检测更加准确，是目前复杂基质中痕量化合物分析最好的检测手段。

本文采用GC-MS/MS多反应监测模式（MRM），克服了GC-MS方法对成分复杂的样品杂质干扰大的缺点，实现复杂样品基质食用植物油，奶粉，油炸膨化类食品及焙烤类食品等中3-MCPDE、2-MCPDE和GE含量的测定。前处理过程包括了提取、酯交换和衍生化等步骤，使用不同的酯交换反应终止液，分别测定3-MCPDE和GE的总量（终止液：氯化钠-冰乙酸溶液）以及3-MCPDE的含量（终止液：硫酸钠-冰乙酸溶液），最后利用差减法得到GE的含量。本方法极大地降低了本底的干扰，提高了检测的选择性和灵敏度，满足了日常油脂和油脂类食品中MCPDE及GE含量的定性和定量检测需要。

1 材料与方法

1.1 原料及试剂

棕榈酸-3-氯丙二醇酯、硬脂酸-2-氯丙二醇酯、棕榈酸-缩水甘油酯、棕榈酸-d5-3-氯丙二醇酯（纯度大于98%，均购自加拿大TRC公司）。甲醇、乙酸、丙酮、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、正己烷、异辛烷（HPLC级，美国Thermo Fisher公司）；甲醇钠、无水硫酸钠、氯化钠、苯基硼酸（PBA），均为分析纯；实验用水为Milli-Q超纯水；食用植物油、奶粉、油炸膨化类食品以及焙烤类食品基质的样品，均为通过超市购买、日常法定委托等收集到的样品。

1.1.1 标准溶液的配制

混合标准储备溶液：分别准确称取适量的棕榈酸-3-氯丙二醇酯、棕榈酸-2-氯丙二醇酯和棕榈酸-缩水甘油酯标准品，用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液溶解，分别配制成浓度为500 mg/L的单一标准储备溶液。移取经纯度折算后的适量单一标准储备液混合配制成浓度为20 mg/L的混合标准储备溶液。

内标溶液：准确称取适量的内标物质，用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液溶解，配制成浓度为20 mg/L的内标溶液。

1.1.2 所用试剂的配制

叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液：量取80 mL叔丁基甲醚和20 mL乙酸乙酯，混匀。

甲醇钠/甲醇溶液：称取固体甲醇钠2.70 g于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至100 mL。

氯化钠/冰乙酸溶液：称取氯化钠固体20 g，溶于100 mL水中，加入4 mL冰乙酸，混匀。

硫酸钠/冰乙酸溶液：称取硫酸钠固体10 g，溶于100 mL水中，加入4 mL冰乙酸，混匀。

丙酮-水溶液：量取19 mL丙酮和1 mL水，混匀。

PBA溶液：称取PBA固体2.5 g溶于20 mL丙酮-水。

1.2 仪器与设备

TQ8040气相色谱-串联质谱仪（配有电子轰击电离源），日本岛津公司；VORTEX 4涡旋混合器，德国IKA公司；4k-15冷冻离心机，美国Sigma公司；Turbo Vap@ LV氮气浓缩仪，瑞典 Biotage公司；memmert D-91126水浴恒温振荡器，北京五洲东方科技发展有限公司；超声波清洗器，瑞士SONOSWISS公司；Milli-Q纯水机，美国Millipour公司。

1.3 样品处理

1.3.1 提取

1.3.1.1 奶粉样品、油炸膨化类食品样品及焙烤类食品

称取粉碎均匀的颗粒或粉末状试样 2 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中（每个样品做两份），准确加入50 μL20 mg/L内标溶液、2.0 mL去离子水和5 mL正己烷，混匀，超声提取15 min，以不低于10000 r/min转速离心10 min。取出后移取上清液于新的15 mL离心管中，重复提取2～3次，合并提取液。于45 ℃环境下用氮气浓缩提取液至5 mL，加入1 mL叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液稳定体系，此溶液作为待反应液。

1.3.1.2 食用植物油样品

称取0.5 g（精确至0.001 g）样品于15 mL离心管中（每个样品做两份），准确加入50 μL的20 mg/L内标物溶液，再加入2 mL叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液，超声混合提取15 min，作为待反应液。

1.3.2 酯交换反应

加入0.5 mL 0.5 mol/L甲醇钠-甲醇溶液进行酯交换反应，严格控制反应时间为 7 min，然后向两份样品中分别加入 3 mL硫酸钠-乙酸溶液（测定3-MCPDE）和3 mL氯化钠-乙酸溶液（测定3-MCPDE和GE的总量），充分振荡，使酯交换反应及时终止。分别向两份样品中加入3 mL正己烷进行脱脂，充分混匀后静置，待水相有机相分层明显后，吸取上层弃去，脱脂操作进行2遍。

1.3.3 衍生化反应

脱脂后，向各离心管中加入0.2 mL PBA溶液，振荡混匀后，置于水浴恒温振荡器中，于70 ℃水浴衍生反应20 min。衍生后冷却至室温，加入5 mL乙酸乙酯涡旋提取 2 min，移取上层液体至吹氮管，重复提取2次，提取液于40 ℃下用氮气吹干，残留物用1 mL异辛烷定容，充分涡旋混合后过有机滤膜，滤液作为待测样液供GC-MS/MS分析。

1.4 实验条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：5%苯基-甲基聚硅氧烷毛细管柱（DB-5ms，30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：280 ℃；程序升温：50 ℃保持1 min，以5 ℃/min的速率升温至 210 ℃，再以 30 ℃/min的速率升温至280 ℃，保持5 min；进样量：1 μL；不分流进样。

1.4.2 质谱条件

离子源：EI源；离子源温度：250 ℃；四极杆温度：150 ℃；色谱-质谱接口温度：280 ℃；电子能量：70 eV；电子倍增器电压：1500 V；溶剂延迟时间：3 min；扫描方式：多反应监测模式（MRM）；优化后选择母离子、子离子及碰撞能量见表1。

表1 子母离子碰撞能量表Table 1 Selection of mass spectrometer collision energy for identification of 3-MCPD-PBA, d5-3-MCPD-PBA and 2-MCPD-PBA

2 结果与讨论

2.1 GE转化率的试验

在空白溶剂和蛋糕中分别进行了 GE转化为3-MCPDE衍生物的转化率试验。分别配制3-MCPDE和GE 标准工作液浓度为20 μg/L、50 μg/L、200 μg/L、500 μg/L和1000 μg/L，添加到空白乙酸乙酯溶剂和蛋糕中，经过提取、酯交换反应（氯化钠溶液终止反应）、衍生化反应后测定。结果表明：GE无论在空白溶剂还是蛋糕基质中，在上述前处理条件下都能 100%转化为3-MCPDE的衍生物。因此，在进行实际样品检测时，每个样品需要做两份对照，一份用于测定3-MCPDE的总量（包括3-MCPED和GE），一份单独测定3-MCPDE和2-MCPDE含量，最后利用差减法即可得到GE的含量。

2.2 样品前处理优化

2.2.1 提取条件的优化

对食用植物油、奶粉、油炸膨化食品和焙烤食品四类基质进行了实验，参照GB 5009.191-2016[26]的前处理方法采用超声提取的方法，向油脂样品中加入叔丁基甲醚-乙酸乙酯（8:2），奶粉、油炸膨化食品和焙烤食品加入正己烷，置于超声波清洗仪中进行超声提取。利用控制变量法，以超声混合时间为变量，分别设置为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，其他实验条件不变，结果发现：超声提取时间为15 min时，3-MCPDE总量测定的峰面积最大。

2.2.2 酯交换条件的优化

2.2.2.1 内标物的影响

研究发现：对同一个样品使用d5-3-MCPDE为内标时，比使用的 d5-3-MCPD为内标时的测定的含量高7～15%，因此本研究中使用棕榈酸-d5-3-MCPDE作为内标物从而得到更为准确的结果。

2.2.2.2 酯交换试剂用量与酯交换时间条件优化

表2 酯交换试剂用量和时间优化结果Table 2 Optimization of transesterification reagents dosage and hydrolysis time

甲醇钠-甲醇溶液加入后，3-MCPDE脱去两个酰基，GE则打开C-O键，加入氯化钠-冰乙酸溶液后，均生成3-MCPD。甲醇钠是一种强亲核试剂，水解时间过长会导致水解产物3/2-MCPD的降解，从而影响最终的检测结果[20]，因此需要严格控制酯交换反应的时间。以3-MCPDE为研究对象，设置酯交换试剂甲醇钠/甲醇溶液用量分别为0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL和0.6 mL，设置水解时间分别为30 s、1 min、3 min、5 min、7 min、8 min、9 min 和10 min，酯交换反应试剂用量和时间优化结果见表 2，选择酯交换试剂甲醇钠-甲醇溶液用量为0.5 mL，水解时间为7 min为最优条件，以提高实验灵敏度。

2.2.3 衍生化条件的优化

在衍生反应中，加入衍生试剂 PBA溶液，目标物转变为在GC-MS/MS中响应更高的4-氯甲基-2-苯基-1,3,2-二噁唑环戊硼烷。采用控制变量法，研究PBA用量、衍生时间和衍生温度三个变量的最优条件。优化结果见表 3，综合时间和经济成本考虑，当衍生试剂PBA用量0.2 mL，衍生时间20 min，衍生温度为70 ℃时，检测响应最高，灵敏度最好。

表3 衍生条件优化结果Table 3 Optimization of derivative conditions

2.3 气相色谱及质谱测定条件的优化

2.3.1 气相色谱条件优化

鉴于本方法需要分离的目标物为d5-3-MCPD-PBA、3-MCPD-PBA和2-MCPD-PBA，所以在三种衍生物出峰时段选择保持较慢的升温梯度5 ℃/min，可将它们分开。比较了选择不分流、分流比分别为 2:1、5:1、10:1、20:1以及 50:1时 GC-MS联用仪分析的灵敏度。实验结果显示：分流比越大，氯丙醇酯的响应越低，

灵敏度越低；不分流进样时的色谱峰可以达到充分分离，且峰型对称、尖锐，故本实验的进样方式选择不分流进样。

2.3.2 质谱检测条件优化

使用 1 mg/L标准溶液，采集全扫描谱图，3-MCPD-PBA以m/z147和m/z91作为母离子，d5-3-MCPD-PBA以m/z150和m/z93作为母离子，2-MCPD-PBA以m/z196和m/z104作为母离子，进行子离子扫描，通过对不同碰撞能量进行优化。

图1 3-氯丙醇酯内标、3-氯丙醇酯和2-氯丙醇酯衍生物总离子流图Fig.1 TIC of d5-3-MCPD-PBA, 3-MCPD-PBA and 2-MCPD-PBA

图2 3-氯丙醇酯内标、3-氯丙醇酯和2-氯丙醇酯衍生物质量色谱图Fig.2 Mass chromatogram of d5-3-MCPD-PBA, 3-MCPD-PBA and 2-MCPD-PBA (200ppb)

结果显示：3-MCPD-PBA中，定量离子对m/z147和m/z91的最佳碰撞能量为12 V，m/z196和m/z147、m/z91和m/z65选为定性离子对，其最佳碰撞能量分别为9 V和12 V；d5-3-MCPD-PBA中，定量离子对m/z150和m/z93的最佳碰撞能量为15 V，m/z201和m/z150、m/z201和m/z93选为定性离子对，其最佳碰撞能量分别为9 V和24 V；2-MCPD-PBA中，定量离子对m/z196和m/z104的最佳碰撞能量为15 V，m/z104和m/z77、m/z196和m/z91选为定性离子对，其最有碰撞能量分别为15 V和9 V。采用多反应监测模式，消除了复杂基质的干扰，提高监测的灵敏度和准确度。

2.4 线性范围、线性方程和定量限

根据优化后的实验条件，取适量体积的叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液将混合标准储备溶液稀释（每个标准品做两份对照），配制成相应浓度的混合标准工作溶液，经过酯交换反应和衍生化反应的处理步骤，得到单独的3-MCPDE测定曲线和3-MCPDE总量测定曲线。经GC-MS/MS测定后，以峰面积比（目标物定量离子峰面积/内标物定量离子峰面积）为Y轴，浓度比（目标物浓度/内标物浓度）为X轴作图，分别得到标准曲线及线性方程，以10倍的信噪比对应的浓度作为本方法的定量限，详细结果见表4。

2.5 方法的回收率和精密度

分别从食用植物油、奶粉、油炸膨化食品和焙烤食品4种基质中，选择橄榄油、婴幼儿奶粉基粉、油含量较低的膨化食品和自制蛋糕，进行了回收率和精密度实验。针对不同样品添加2～3个不同浓度水平标准溶液，按实验方法进行测定，每个浓度水平做6份平行样品，回收率和相对标准偏差（RSD%）结果见表5。

表4 四种样品基质的线性方程，线性范围，相关系数及定量限Table 4 Regression equations, linear range, correlation coefficients(R), and limits of quantitation (LOQs) of 4 samples

表5 四类食品样品中3-MCPDE和GE不同添加水平回收率数据Table 5 Recoveries and relative standard deviation of 3-MCPDE and GE in 4 food samples(n=6)

由表5可知，四种不同基质样品的平均回收率范围在68.9～116.5%，RSD范围在2.11%～13.90%，方法精密度及准确度良好。

3 结论

本文对多种食品复杂基质的前处理方进行了优化，采用GC-MS/MS检测技术达到了同时检测不同食品样品中3-MCPDE、GE和2-MCPDE含量的目的。方法具有可操作性强，方法灵敏，精密度高，准确度好等特点，能够满足日常工作中植物油类、奶粉类、油炸膨化食品类和焙烤食品类等基质中 3-MCPDE、GE和 2-MCPDE的定性定量检测，为食品中的3-MCPDE、GE和2-MCPDE含量的检测标准制定和本底调查提供重要依据。

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