四爿藻培养模式的筛选及其培养基的优化

符新欢 王珺 王永强 梁业松 陈国华 詹景福

摘要 [目的]为了提高热带四爿藻的生长速率。[方法]以“宁波大学3#微藻培养基”为基础，分别添加有机碳（葡萄糖和乙酸钠）对四爿藻进行自养、兼养及异养培养，筛选出促进四爿藻快速生长的培养模式，并通过单因子及正交试验，优化其培养基配方。然后用优化培养基与“宁波大学3#微藻培养基”对比培养四爿藻。[结果]乙酸钠是四爿藻兼养培养的适宜有机碳，其最佳的乙酸钠浓度为6 g/L。获得了四爿藻的兼养培养基为：6 g/L CH3COONa、50 mg/L NH2CONH2-N、2 mg/L Ca（H2PO4）2-P、1 mg/L FeSO4-Fe、1 mg/L Vitamin B1、0.000 5 mg/L Vitamin B12和0.5 mg/L Vitamin H。优化兼养培养基与“宁波大学3#微藻培养基”对比培养四爿藻的结果表明，培养第7天，兼养培养收获的藻细胞密度、干重分别达到3.84×106 cells/mL及1.14 g/L，分别是“宁波大学3#微藻培养基”的2.83倍、3.12倍。[结论]四爿藻进行兼养培养可獲得高密度培养。

关键词 四爿藻；兼养；培养基；生长

中图分类号 Q949.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）01-0080-04

Abstract [Objective]To improve the growth rate of Tetraselmis chui .[Method] Based on “Ningbo University#3 medium”， organic carbon （C6H12O6 and CH3COONa）was added for the autotrophic culture， mixed culture and heterotrophic culture， respectively ， and the mixotrophy medium of T. chui was further optimized by single factor test and orthogonal test. And then， the results of mixotrophic and autotrophic cultures were compared. [Result] CH3COONa was the better organic carbon applicable for the mixotrophic culture on T. chui . The optimization of mixotrophy medium was 6 g/L CH3COONa， 50 mg/L NH2CONH2-N， 2 mg/L Ca（H2PO4）2-P， 1 mg/L FeSO4-Fe， 1 mg/L Vitamin B1， 0.000 5 mg/L Vitamin B12 and 0.5mg/L Vitamin H. The cell density and dry weight of the “mixotrophy medium” was up to 3.84×106 cells/mL and 1.14 g/L after culturing seventh day， respectively， being 2.83/3.12 times higher than the cell density and dry weight of “Ningbo University #3” medium. [Conclusion] T. chui can be cultured with high cell density through mixotrophic culturing.

Key words Tetraselmis chui ；Mixotrophic culture；Medium；Growth

四爿藻（ Tetraselmis chui ）是绿藻门绿藻纲团藻目衣藻科四爿藻属的一种运动很快的单细胞绿藻，能进行光合放氧作用，繁殖速度快，并含有丰富的营养物质，是鱼、虾幼体和贝类的优良饵料[1-3]。因四爿藻特殊的化学组成和系统位置，受到国内、外学者的普遍关注[4]。目前，人工培养四爿藻技术已经受到重视[5-8]。如何提高四爿藻细胞生长速率，缩短培养周期，是当前需要致力解决的关键问题。微藻的兼养培养由自养生长和异养生长两部分组成，是在利用光能和CO2的同时，以有机碳作为补充碳源和能源的一种培养方法。微藻通过利用有机碳补充光能自养，兼养培养可提高微藻的生长速率[9-12]。在有机酸碳源中，最重要的是醋酸盐，它比任何脂肪酸或其他有机酸更有效，是异养培养的良好碳源[13]。该试验以常用的“宁波大学3#微藻培养液” [13]为基础，分别添加不同质量浓度的有机碳（葡萄糖和乙酸钠）对四爿藻进行自养、异养及兼养培养，筛选出最佳的培养模式及有机碳种类、浓度。并在最优培养模式下分别通过单因素和正交试验研究不同种类及浓度的氮源、磷源、铁源、维生素B1（VB1）、B12（VB12）及维生素H（VH）等主要营养元素对四爿藻生长速率的影响，筛选出最佳的培养基配方，旨在提高四爿藻的生长速率，为四爿藻的大规模高密度生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用四爿藻原种取自海南省陵水县自然海区，经过微吸管法分离挑取单个细胞，在“宁波大学3#微藻培养液”中进行无菌纯化扩增培养。藻细胞长（11.5～16.5） μm，宽（7.5～9.5） μm，厚（4.3～5.5） μm；在细胞前端凹陷中伸出4根等长的鞭毛。试验前进行无菌纯培养藻种，取指数生长期的无菌藻株用于试验。

1.2 方法

1.2.1 藻体培养条件。试验用海水取自海口市新埠岛海区，海水盐度32.5，pH 8.10，经过500目筛绢网及脱脂棉花小水滴过滤，再煮沸灭菌，自然冷却。试验用培养瓶为250 mL齿轮牌三角瓶，经过洗液消毒，洗涤、晾干，再经130 ℃高温灭菌2 h，自然冷却后使用。试验操作过程均在无菌条件下进行。试验温度为（26±0.5）℃，光强为3 500 lx，光照周期为14 L∶10 D。每天摇藻4次，并随机交换试验瓶位置，以减少光照误差。

1.2.2 试验设计。

1.2.2.1 单因子试验。有机碳的筛选：以“宁波大学3#微藻培养基”作为基础培养基，分别添加有机碳进行异养及兼养培养，乙酸钠设计的浓度梯度为0、3、6、9和12 g/L，葡萄糖设计的浓度梯度为0、10、15、20和25 g/L，筛选出适宜的有机碳及其最适浓度；采用以上试验筛选出最适的培养模式及其有机碳源，以“宁波大学3#配方”为基础培养基，分别配制缺氮盐、缺磷盐、缺铁盐的培养液。氮源种类及质量浓度的筛选：分别以硫酸铵（NH4）2SO4、硝酸钠（NaNO3）、尿素（NH2CONH2）为氮源，其氮（N）的质量浓度梯度分别为0、20、35、50、70 mg/L；磷源种类及质量浓度的筛选：分别以磷酸二氢钾（KH2PO4）、过磷酸钙[Ca（H2PO4）2]为磷源，磷（P）的质量浓度分别为 0、1、2、3、4、5、6、7、8 mg/L；铁源种类及质量浓度的筛选：以硫酸亚铁（FeSO4）及柠檬酸铁（C6H5O7Fe）為铁盐，设置铁（Fe）质量浓度梯度为 0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mg/L。各试验均设置2个水平。

1.2.2.2 维生素B1、B12和维生素H正交试验。针对微藻对维生素的需求，设计三因素四水平正交试验（表1）。

1.2.2.3 优化培养基验证试验。通过上述单一因素及正交试验获得适宜四爿藻生长繁殖的优化培养基。选取优化培养基与常用的“宁波大学3#微藻培养基”对比培养四爿藻，验证优化培养基的培养效果。藻液接种密度、海水盐度、pH、温度与光照等培养条件保持一致，每天定时固定、计数，共培养7 d。

1.2.3 藻细胞密度计数。首先取一定量的四爿藻液稀释成5个浓度梯度，用 722S 可见分光光度计分别测定吸光度，同时用 XB-K-25 血球计数板计数（计数用的藻液用少许甲醛固定，当天计数，每瓶重复 2～3 次，取平均值），确定试验藻液的藻细胞密度与OD值的线性关系。测定试验藻液的OD值，根据OD值与藻细胞密度的关系换算成藻细胞密度。

1.2.4 藻细胞干重的测定。准确量取各试验藻液50 mL，将其转移至预先干燥过并已称重的孔径为 3 μm Whatman GF/C滤膜上抽滤收获藻细胞，并用盐度为5的水冲洗3次（避免超纯水冲洗导致藻细胞破裂）。再将附有藻细胞的滤膜置于干净称量瓶（内垫有已编号的锡箔纸）内，置于恒温干燥箱55～60 ℃烘干6 h后，用感量为0.1 mg的电子天平称重，再次烘干，称重，直至恒重。根据干藻重量和藻液体积计算出 1 L 藻液中的生物质干重（g/L）。

1.2.5 比生长速率（ K）的计算。藻细胞的比生长速率（K）计算公式如下：

K=（ ln Wt- ln W0）/t

式中，W0：培养初始的藻细胞数；Wt：经过t时间培养后的藻细胞数；t ：培养时间（d）。

1.2.6 统计分析。运用Excel软件进行数据处理及作图，并使用DPS数据处理系统进行数据统计分析（方差分析、LSD多重比较）。

2 结果与分析

2.1 单因子试验

2.1.1 有机碳的筛选。CH3COONa与C6H12O6对四爿藻自养、兼养和异养的生长效应见图1。由图1可知，四爿藻既能够进行光合自养生长，又可以在有光条件下利用有机碳源进行兼养生长，但几乎不能在黑暗条件下进行异养生长；培养模式从优到劣的顺序为兼养、自养、异养；H3COONa为有机碳的培养效果优于C6H12O6。试验结果表明，添加乙酸钠进行兼养培养的四爿藻细胞饱满，平均大小比自养藻细胞大。经单因素方差分析得知，添加6 g/L乙酸钠对四爿藻的兼养生长有显著影响（ P <0.05）。

2.1.2 氮源的筛选。从图2可以看出，尿素、硝酸钠、硫酸铵均可作为四爿藻的氮源。最适合四爿藻兼养生长的氮源为尿素，以50 mg/L 为最佳，其次为20 mg/L硫酸铵。经单因素方差分析得知，3种氮源对四爿藻生长的影响均极显著（ P <0.01）。

2.1.3 磷源的筛选。从图3可以看出，磷酸二氢钾和过磷酸钙均可以作为四爿藻生长需要的磷源；最佳的磷质量浓度为2.0 mg/L过磷酸钙。经单因素方差分析，磷源对四爿藻的生长有极显著影响（ P <0.01）。

2.1.4 铁源的筛选。从图4可以看出，柠檬酸铁和硫酸亚铁均可作为四爿藻兼养培养的铁源，其中以1.00 mg/L硫酸亚铁为最佳。经单因素方差分析，得知铁源对四爿藻的生长有极显著影响（ P <0.01）。

2.2 维生素B1、B12和维生素H正交试验

通过正交试验结果可知，试验号10的组合最适合四爿藻的兼养培养，其质量浓度分别为1 mg/L VB1、0.000 5 mg/L VB12和0.5 mg/L VH。（表2）。

2.3 优化兼养培养基的验证

优化兼养培养基与“宁波大学3#微藻培养基”的对比培养试验结果见图5。从图5可知，四爿藻在兼养优化培养基中显示出较大的生长优势，从第2～7天，优化兼养培养基比“宁波大学3#自养培养基”收获四爿藻的生物量（细胞密度）分别提高了1.31、1.42、2.09、2.20、2.39和2.83倍。培养第7天，兼养四爿藻细胞密度达3.84×106 cells/mL，细胞干重为1.14 g/L。

3 讨论

微藻需要从外界吸收营养元素来作为自身生长需要的必需元素，不同的微藻对营养元素的需求各不一样。兼养培养由光合自养及异养两部分组成，既可以利用光能，又可以利用有机碳源进行生长繁殖，兼养培养有机碳源提供的能量减轻了微藻的生长对光合作用的依赖，因而，有些微藻得到有机碳源后，生长发育更快、更好。

3.1 有机碳

有些微藻在得到有机质后，生长更适宜[13]。龙元薷等[11]研究表明，雨生红球藻（ Haematococcus pluvialis ）兼养比自养更有利于红球藻细胞密度的增加，兼养生长的适宜乙酸钠质量浓度为1.5 g/L，兼养培养的最大藻细胞密度可达自养培养的3.12倍。同时指出不同藻株对乙酸钠的需求量并不一致，为了实现生物量的有效增加，需要对具体藻株添加适量的乙酸钠。赫冬梅等[12]研究表明，随着葡萄糖和乙酸钠浓度的增加，湛江等鞕金藻（ I.zhanjianggensis ）的生长表现出先促进后抑制的现象，葡萄糖对生物量具有显著促进作用的浓度为15 g/L，而乙酸钠具有显著促进作用的浓度为2.5～15.0 g/L。试验结果表明，四爿藻可以利用乙酸钠进行兼养生长，当乙酸钠的浓度在0～6 g/L时， K 值随乙酸钠浓度增大而增大，添加6 g/L 乙酸钠K值达到最大值，为最佳添加量，当乙酸钠浓度在6～12 g/L 时， K 值随乙酸钠浓度的增大而减小，即有机碳浓度超出适宜浓度范围时生长速率下降；四爿藻利用乙酸鈉进行兼养生长的能力是有限的。而该试验设置的葡萄糖的添加未能促进四爿藻的生长。

3.2 氮盐

氮是组成细胞生物膜、原生质和细胞核的重要成分，在生命活动中有着特殊的作用[14]。在微藻生长繁殖过程中氮是最重要的大量元素之一，不同微藻对氮源的种类及浓度需求各异[13]。郑晓宇等[15]研究表明，四尾栅藻（ Scenedesmus quadricauda ）最适生长的氮质量浓度范围为16～32 mg/L。宋邦兴等[16]研究表明，翼茧形藻的（ Amphiprora alata ）最适生长的氮质量浓度为 40 mg/L NaNO3-N。试验结果表明，硝酸钠、尿素、硫酸铵均能被四爿藻利用，其中以50 mg/L NH2CONH2-N为四爿藻兼养培养的最佳氮源，（NH4）2SO4-N 次之。（NH4）2SO4-N和NaNO3-N最佳的质量浓度均为20 mg/L，高于或低于最佳质量浓度的含氮量对四爿藻的生长均有不同程度的抑制作用，当（NH4）2SO4-N的质量浓度达50 mg/L时，四爿藻的生长受到严重的抑制，这是由于（NH4）2SO4中的NH+4易变为NH3，使藻细胞受到毒害作用。

3.3 磷盐

磷是微藻正常生长需要的大量营养元素之一，在生命活动中起着至关重要的作用，光合作用时能量的转化、叶绿体的合成等均不能缺少磷参与。沈盎绿等[17]研究表明，东海原甲藻（ Prorocentrum donghaiense ）和米氏凯伦藻（ Karenia mikimotoi ）在试验后期较低磷酸盐水平的情况下仍然能维持较高细胞浓度，说明藻细胞内存在明显的营养盐库。该试验结果显示，空白对照组的四爿藻在氮、磷含量很低的情况下（自然海水带有的少量氮、磷）仍然能维持1周较好的生长（ K 值分别为0.42与0.50），添加氮、磷盐生长最好的试验组（ K 值为0.55与0.65），表明四爿藻细胞内存在营养盐库；KH2PO4和Ca（H2PO4）2均可作为磷源，两者均以磷含量为2 mg/L为最佳，其中Ca（H2PO4）2效果极显著优于 KH2PO4（ P <0.01）。2种磷源均在P浓度范围为1～2 mg/L时， K 值随着P浓度增高逐渐增大，而在P浓度范围为2～8 mg/L时， K 值随着质量浓度增加逐渐减小；表明高质量浓度的磷盐对四爿藻的生长有抑制作用。

3.4 铁盐

铁是藻类生长发育必需的矿质营养元素之一，在藻类呼吸作用、光合作用、蛋白质与核酸合成、固氮作用等生理代谢过程中具有重要的作用[18]。刘彩霞[19]研究指出，小球藻（ Chlorella vulgaris ）在缺铁培养下小球藻生长速率降低。凌娜等[20]研究表明，蛋白核小球藻（ Chlorella pyrenoidosa ）生长的最适铁的浓度为1.4 mg/L。该试验结果表明，FeSO4及FeC6H5O均可作为四爿藻的铁源，铁元素对其生长有显著差异（ P <0.05）。最佳的铁浓度为1 mg/L，铁质量浓度大于1.5 mg/L时，抑制四爿藻的生长。四爿藻兼养培养最佳的铁盐FeSO4-Fe为1.00 mg/L。

3.5 维生素B1、B12和VH正交试验

B族维生素（VB1、VB12、VH）是微藻类生长繁殖必不可少的营养素。孙颖颖等[21]研究表明，在球等鞭金藻添加VB1和VB12时，球等鞭金藻（ Isochrysis galbana ）生长优于单独添加。欧阳叶新等[5]研究表明，在四爿藻培养液加入维生素B12可适当增加生长速率。该试验结果表明，添加1 mg/L VB1、0.000 5 mg/L VB12及0.5 mg/L VH可以极显著增加四爿藻的生长速率（ P <0.01）。

3.6 优化培养基的验证

已有研究表明，微藻兼养的培养效果并非异养与自养的简单叠加，而是多种因素的综合性效应[11-22]。该研究用优化兼养培养基与“宁波大学3#微藻培养基”对比培养四爿藻，结果表明，培养第7天，兼养培养收获的细胞密度、干重分别达到3.84×106 cells/mL 及1.14 g/L，分别是“宁波大学3#培养基”的2.83倍及3.17倍。

4 结论

四爿藻利用乙酸钠进行兼养培养可获得高密度培养。

获得四爿藻兼养优化培养基配方为：6 g/L CH3COONa、50 mg/L NH2CONH2-N、2 mg/L Ca（H2PO4）2-P、1 mg/L FeSO4-Fe、1 mg/L VB1、0.000 5 mg/L VB12和0.5 mg/L VH。

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