氨氮胁迫对虎纹蛙血液中部分生理生化指标的影响

黄艳 黎慧 李斌 刘盼 邵晨 王宇

摘要 [目的]探明氨氮胁迫对虎纹蛙（ Hoplobatrachus chinensis ）的毒性效应。[方法]采用96 h静态毒性试验法研究了不同浓度和不同暴露时间的氨氮对虎纹蛙血糖（Glu）、高铁血红蛋白（MetHb）、尿素氮（BUN）和血氨（BA）的影响。[结果]随暴露时间的增加，Glu浓度出现显著的先升后降，并在72 h后达到最大值；MetHb含量和BUN浓度则随氨氮浓度的增加或者暴露时间的延长而增加；而BA则只在48～72 h的不同暴露时间下具有较大的变化。[结论]为降低氨氮对人工养殖虎纹蛙的影响，需要将养殖水体的氨氮浓度控制在59.46 mg/L以下。

关键词 虎纹蛙；氨氮胁迫；血液生理生化指标

中图分类号 S947.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）01-0087-04

Abstract [Objective] In order to understand the toxic effects of ammonia-N stress on blood physiological-biochemical indices of Hoplobatrachus chinensis .[Method] 96 h static toxicity tests in different concentrations and exposure time were used to evaluate the effects of ammonia-N on the concentration of blood glucose （Glu）， methemoglobin （MetHb）， blood urea nitrogen （BUN） and blood ammonia （BA）. [Result] With the exposure time increase， Glu concentration increased first and then decreased and it reached the maximum value at 72 h treatment；MetHb and BUN showed significant positive correlation with ammonia-N concentration or exposure time under the circumstance of the same exposure time or concentrations. Blood ammonia concentration changed significantly with exposing for 48-72 h. [Conclusion] It would be better to control the ammonia-N concentration under the safety level （59.46 mg/L） to reduce the effect of ammonia-N on breeding H.chinensis .

Key words Hoplobatrachus chinensis ；Ammonia-N stress；Blood biochemical indices

氨氮是养殖水体中最常见的污染物之一。在养殖过程中因投饵过多、养殖密度过大以及滥用杀菌剂和消毒剂等因素都会使水体中有机物含量增多，造成养殖水体氨氮的不断累积，进而对养殖动物产生毒害作用[1-2]。已有研究显示，氨氮胁迫将导致养殖动物的鳃、肾和肝脏等器官发生病变[3-4]，包括引起鳃部溃烂，鳃小片显著增厚，肾小管退化，肾小囊出现膨胀、囊腔充血和阻塞以及肝脏组织充血、退化、坏死等症状[5-7]。此外，动物机体的呼吸系统、血液循环系统、排泄系统也会受到氨氮的影响，引起免疫力下降，并导致动物体病原菌易感性增强，最终影响其生长和存活[1，8-12]。然而，上述关于氨氮胁迫对水生动物毒性的研究目前主要集中在鱼类和甲壳动物，对两栖动物的毒性效应研究尚未见报道。两栖动物是脊椎动物从水生过渡到陆生的重要类群，其生命活动的各个阶段均离不开水环境。因此，以氨氮为代表的养殖水体污染可能是制约两栖动物健康养殖的潜在重要因素。

虎纹蛙（ Hoplobatrachus chinensis ）是我国Ⅱ级保护野生动物，由于栖息地破坏及人类滥捕等因素导致其野生种群数量急剧下降。為满足人类的消费需求，目前虎纹蛙已在海南、广东、浙江等地开展了产业化养殖。该研究拟以虎纹蛙为研究对象，采用96 h静态毒性实验法，通过研究不同浓度和不同暴露时间氨氮对虎纹蛙血糖（Glu）、高铁血红蛋白（MetHb）、尿素氮（BUN）和血氨（BA）含量变化的影响，以期为探讨虎纹蛙的人工健康养殖和氨氮对两栖动物的毒害机制提供重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用虎纹蛙种群来自浙江省金华市某虎纹蛙养殖场。试验前将体质健康、规格相近[体重（181.17±1.36） g，体长（12.58±0.12） cm]的虎纹蛙成体置于水族箱（90 cm×40 cm×40 cm）中驯养7 d，控制水温为（22±1）℃，pH为7.0±0.1，溶氧量为（8.7±0.1）mg/L。每24 h用曝气脱氯的自来水换水1次，并定时投喂虎纹蛙专用饲料（漳州市联泰饲料有限公司）。

1.2 试验设计

1.2.1 半致死浓度试验。

在预试验确定虎纹蛙24 h全部死亡和96 h全部存活的氨氮浓度后，在该浓度范围内按照等对数梯度设计7个氨氮浓度组：220.00、293.37、391.22、521.70、695.70、927.73和1 237.15 mg/L，每个氨氮浓度设置2个平行组，同时设置空白对照组（0 mg/L）。氨氮溶液使用分析纯NH4Cl配制，并采用纳氏试剂法测定溶液的实际氨氮浓度，每24 h更换新配制的试验溶液。试验中观察记录不同浓度组在不同时间（24、48、72 和96 h）各个体的活动状况、中毒症状和死亡个体数量，并及时去除死亡个体。

1.2.2 暴露试验。

根据上述半致死浓度试验结果，设置4个氨氮浓度组：0、120、360和600 mg/L，其中0 mg/L为对照组，其他浓度为处理组，每组2个平行（30只/每平行），试验持续96 h。

1.3 血液样品制备与检测

暴露试验期间，分别于0、24、48、72和96 h在每个浓度组中随机采集6只虎纹蛙样本于冰上毁髓断头取血。将血液置于含有EDTA抗凝剂的2 mL无菌离心管中，4 ℃静置12 h，3 500 r/min离心15 min，取上清液于-80 ℃超低温冰箱保存备用。Glu、MetHb、BUN和BA的含量均使用南京建成生物工程研究所的相关试剂盒进行测定，测定方法和步骤参照试剂盒说明书。

1.4 数据处理

以氨氮浓度和暴露时间作为自变量进行双因素方差分析（Two-Way ANOVA），若二因素间无显著交互作用，则进行二因素的主效应分析；若二因素间有显著交互作用，则固定其中1个因素的水平，对另一个因素进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）。用LSD多重比较法进行组间差异显著性检验。试验数据以平均值 ± 标准误（Mean±SE）表示，采用SPSS 21.0软件包进行统计分析，显著性水平取 α =0.05。氨氮对虎纹蛙的96 h半致死浓度采用直线内插法计算，以“96 h半致死浓度×0.1”作为其安全浓度。

2 结果与分析

2.1 氨氮对虎纹蛙的半致死浓度

半致死浓度（LC50）是受试生物对毒性物质的敏感性指标，其值越小，生物体对毒物越敏感，毒物对生物的毒性也越强[13]。试验结果显示，虎纹蛙从自然水体转入不同浓度的氨氮水体均表现出不同程度的中毒症状，其死亡率随着氨氮浓度的增加或暴露时间的延长而递增，其累积死亡率见图1。氨氮对虎纹蛙的96 h半致死浓度和安全浓度分别为594.62和59.46 mg/L。

2.2 氨氮对虎纹蛙血液中部分生理生化指标的影响

2.2.1 氨氮胁迫对虎纹蛙Glu的影响。

氨氮浓度和暴露时间双因素对虎纹蛙Glu的影响无显著交互作用（ P >0.05），氨氮浓度对Glu无显著影响（ P >0.05）（表1）。主效应分析结果显示，随着暴露时间的延长，Glu先升后降。当暴露时间达到72 h时，Glu显著高于其他暴露时间（图2）。

2.2.2 氨氮胁迫对虎纹蛙MetHb的影响。

氨氮浓度和暴露时间双因素对虎纹蛙MetHb的影响有显著交互作用（ P <0.05），氨氮浓度和暴露时间均对MetHb有显著影响（ P <0.05）（表1）。控制其中一个因素后所进行的单因素方差分析结果显示：在相同氨氮浓度下，MetHb随着暴露时间的延长而显著增加；而相同时间内，MetHb随着氨氮浓度的升高而显著增加（图3）。

2.2.3 氨氮胁迫对虎纹蛙BUN的影响。

氨氮浓度和暴露时间双因素对虎纹蛙BUN的影响有显著交互作用（ P <0.05），氨氮浓度和暴露时间均对BUN有显著影响（ P <0.05）（表1）。单因素方差分析结果显示，在同一氨氮浓度下，BUN随着暴露时间的延长而缓慢增加，96 h时增加显著；而在同一暴露时间下，隨着氨氮浓度的增加，BUN在24 h时并未升高，而在48、72和96 h时则显著升高（图4）。

2.2.4 氨氮胁迫对虎纹蛙BA的影响。

氨氮浓度和暴露时间双因素对虎纹蛙BA的影响无显著交互作用（ P >0.05）（表1）。结果分析显示，BA在不同氨氮浓度下，暴露组均显著高于对照组，但暴露组之间无显著性差异（图5）；在不同暴露时间下，BA 96和72 h均显著高于24和48 h，但96和72 h之间、24和48 h之间均无显著差异（图6）。

3 结论与讨论

氨氮在水体中主要以离子氨（NH+4）、分子氨（NH3）和铵盐等形式存在，是普遍存在于水产养殖水体中的有害物质。不同水生动物对氨氮毒性的敏感性存在较大差异，具有不同的耐受性[14-16]。研究表明虎纹蛙对氨氮的96 h半致死浓度和安全浓度均远高于虹鳟鱼（ Oncorhynchus mykiss ）[14]、史氏鲟（ Acipenser schrencki ）[15]和克氏原螯虾（ Procambarus clarkii ）[16]等鱼类和甲壳动物，这可能与动物体自身的生理结构和生活习性有关。虎纹蛙属于两栖类，其生命活动虽然不能完全脱离水生环境，但其成体的主要呼吸器官肺对水体的依赖性要远小于鱼类和甲壳类的水体呼吸器管鳃，因此完全生活于水中的鱼类和甲壳类动物的氨氮胁迫半致死浓度要远大于半水栖的两栖动物。

3.1 氨氮胁迫对虎纹蛙Glu的影响

动物的血液生理生化因子在正常情况下一般处于稳定状态，但在外界环境因素的胁迫下，其动态平衡可能会遭到破坏，并进而导致正常生理功能的失衡。Glu作为动物体血液中的重要生化因子之一，其浓度的变化反映环境胁迫，如高密度放养、捕捉、装载及运输等的重要指标[17-19]。该研究中虎纹蛙的Glu在氨氮胁迫下随暴露时间逐渐增加，并在72 h后达到最大值，随后又在96 h后恢复胁迫前水平。说明在氨氮胁迫初期，虎纹蛙应对自身的能量分流和代谢调整产生了明显的应激效应，引起动物体额外的能量需求，糖异生作用加强，从而导致Glu升高[20]。而随着胁迫时间的延长，蛙体的应激效应通过自身调节得到缓解，Glu恢复正常水平。该结果与氨氮急性胁迫对青鱼（ Mylopharyngodon piceus ）Glu影响的研究结果一致[21]，说明氨氮胁迫能够对Glu产生显著影响。此外，该结果也说明Glu在动物体内的变化具有时效性，仅能作为动物急性反应的重要指标。

3.2 氨氮胁迫对虎纹蛙MetHb的影响

MetHb是由血液中的血紅蛋白经氧化转变而来。正常情况下，动物体内的MetHb含量极少，并处于不断的生成与分解的动态平衡中。该研究虎纹蛙MetHb在氨氮胁迫下随着暴露时间的延长或浓度的增加而显著上升。表明在氨氮胁迫下，水体中的分子氨（NH3）因具有较高的脂溶性而极易穿透虎纹蛙的细胞膜进入体内，将血液中大量的血红蛋白氧化为MetHb，降低血液的载氧能力[22]。观察试验发现，虎纹蛙的游泳和跳跃能力随着氨氮胁迫时间的延长或浓度的增大出现明显减弱的现象，这与对鲶鱼运动能力[23]的研究结果相一致，说明氨氮胁迫可显著增加MetHb在动物体内的含量，降低其体内的含氧量，进而影响水生动物的呼吸系统，引发一系列的生理反应，最终导致虎纹蛙的窒息和死亡。

3.3 氨氮胁迫对虎纹蛙BUN的影响

BUN是动物体蛋白质代谢的主要终末产物，可通过肾脏的过滤和重吸收作用而排出体外。然而，当肾脏发生病变时，肾小球的滤过率快速下降，BUN将不能通过肾脏随尿液排出体外，导致血液中BUN的含量升高，引起代谢絮乱[24]。因此，动物体血液中BUN的含量可用于反映肾脏的健康状况。该研究中虎纹蛙BUN在氨氮胁迫下具有明显的时间和剂量双效应，并与暴露时间的延长或浓度的升高呈正相关，结合相关研究推测氨氮胁迫可能对虎纹蛙的肾脏组织产生不同程度的损伤，如肾小管和动脉球的退化以及肾小囊的膨胀、阻塞、充血和出血等[6-7]。

3.4 氨氮胁迫对虎纹蛙BA的影响

BA是动物体内各种氨基酸经分解代谢产生的氨和肠管吸收的氨进入血液所形成的，通常会维持一个相对较低的含量。然而，在外源性氨源或肝脏发生病变等情况下，动物体内的BA含量会显著上升。该研究虎纹蛙BA在氨氮胁迫下显著增加，但不同浓度的氨氮对虎纹蛙BA的影响并无显著差异；不同暴露时间对虎纹蛙BA变化的影响除48～72 h明显外，其他时间均不显著。该研究结果与氨氮胁迫对鱼类BA的影响不同，并没有出现BA随着氨氮浓度增高和暴露时间的延长而呈显著正相关[25]。推测这可能是虎纹蛙BA在外界氨氮刺激下达到一定阈值后，机体启动自身调节机制来减少外源性氨氮的进入、增加体内氨氮的排泄以及生成谷氨酰胺和BUN等无毒物质，并将其贮存在各组织中，使机体内BA的积累量不再增加[26-28]，从而将BA稳定在一定的水平。

动物的血液生理生化指标可反映出该个体的健康状态，该研究显示氨氮胁迫对虎纹蛙血液中的Glu、MetHb、BUN和BA都具有一定影响。因此，控制虎纹蛙养殖水体中的氨氮浓度在安全范围（< 59.46 mg/L）内将有助于该物种的健康安全养殖。

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