资源植物玉叶金花挥发油的GC—MS分析及体外抗氧化活性研究

潘绒 黄京京 赵玉立 程鑫 李发壮 胡晓倩

摘要 [目的]分析资源植物玉叶金花叶中挥发油的有效成分并评价其体外抗氧化活性。[方法]通过水蒸气蒸馏法提取玉叶金花叶中的挥发油，采用色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析其化学组成。以VC作为对照，以总还原力和对超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力为评价指标，研究玉叶金花挥发油的体外抗氧化活性。[结果]玉叶金花叶挥发油中共鉴定出49个有效成分，占其总量的68.19%，其中包括极具研究和应用价值的N-甲基吡咯（37.37%）和叶绿醇（7.34%）。且在试验浓度范围内，玉叶金花挥发油的总还原力以及对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、ABTS自由基的清除能力均随浓度的增大而增大。[结论]玉叶金花挥发油具有良好的体外抗氧化活性。

关键词 玉叶金花；水蒸气蒸馏法；挥发油；自由基；抗氧化剂；GC-MS

中图分类号 S-3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）01-0173-05

Abstract [Objective] The aim was to analyze chemical components of volatile oils from Mussaenda esquirolli Lévl. and evaluate their antioxidant activity. [Method] The volation oil was extracted by steam distillation， and GC-MS analysis was used to analyze its chemical composition. Compared with VC， the antioxidant activity of volatile oil in vitro was evaluated by total reducing power and scavening effect of superoxide radical， hydroxyl radical， DPPH radical and ABTS radical. [Result] The 49 effective components were identified from the volatile oil in the leaves of Mussaenda esquirolli Lévl. with the GC-MS， accounting for 68.19%， including N-methylpyrrolidine （37.37%） and phytol （7.34%）. And the total reducing power of volatile oil from Mussaenda esquirolli Lévl. and the scavenging capacity of DPPH， superoxide anion， hydroxyl radical and ABT were increased with the increasing concentration. [Conclusion] The volatile oils from Mussaenda esquirolli Lévl. show good antioxidant activity in vitro.

Key words Mussaenda esquirolli Lévl.；Steam distillation；Volatile oil；Free radical；Antioxidation；GC-MS

玉叶金花（ Mussaenda esquirolli Lévl.），又名山甘草、野白紙扇等，是茜草科玉叶金花属（ Mussaenda ）的一种资源植物[1]。玉叶金花的花叶普遍呈白色，是萼片瓣化形成的，花冠呈黄色，有毛附在其表面和内部，花柱较短[2]，极具绿化观赏价值。玉叶金花具有清热解暑，凉血解毒，治疗风湿骨痛、咽喉炎和止渴的功效，由其制成的保健茶，短期饮用具预防流感疾病和提高免疫力等效果，长期饮用可促进微循环，极具药用保健价值[3]。玉叶金花具适应性强、生长速度快、萌芽力强等特点，多用于绿化环境、净化空气、涵养水源、改善环境等方面，极具生态价值[4]。

活性自由基，如超氧阴离子（O-2）、羟自由基（·OH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（ABTS·），能够引起机体损伤病变，通过抗氧化物质及早防止和清除自由基，是治疗由自由基导致的疾病的关键。因此，从植物中提取天然抗氧化物质，如多糖、挥发油和总黄酮等，并研究其抗氧化活性已成为研究热点[5]。

目前，对玉叶金花的研究多集中在形态和分类方面，对玉叶金花功能成分的提取和活性研究涉及甚少[6]。笔者通过水蒸气蒸馏法提取玉叶金花叶的功能成分挥发油，通过GC-MS技术对其化学成分进行检测分析，并通过测定其总还原力以及清除DPPH·、超氧阴离子、羟自由基、ABTS·的能力来评价其体外抗氧化活性，以期为玉叶金花药用价值的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。玉叶金花叶片采自安徽省黄山市屯溪区黄山学院南校区，由黄山学院生命与环境科学学院张慧冲副教授鉴定。

1.1.2 主要试剂。石油醚、无水硫酸钠、无水乙醇、95%乙醇、甲醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、邻苯三酚、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、过硫酸钾、维生素C（VC）等，均为分析纯。

1.1.3 主要仪器。

SXT-02挥发油提取装置（上海洪纪仪器设备有限公司）；HH-S数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器有限公司）；DGX-9073B-2电热鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；PL203型号电子精密天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；HP5890ⅡGC-HP5972A MSD 型气相色谱质谱联用仪（美国安捷伦公司）；TDL-5台式低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；UV754紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；pH酸度计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 挥发油的提取。

按照《中国药典》2010年版附录XD挥发油测定法测定。将采摘的新鲜玉叶金花叶片洗净，置于电鼓风干燥箱（42 ℃）内烘干并研磨成粉末状。取30 g干燥玉叶金花叶片粉末并加入150 mL蒸馏水，42 ℃水浴锅内恒温水浴加热30 min，按照料液比1∶15倒入1 L圆底烧瓶中，连接挥发油提取装置，蒸馏6 h收集挥发油，经无水硫酸钠干燥后置冰箱4 ℃保存备用。

1.2.2 GC-MS测定条件。

1.2.2.1 GC-MS色谱条件。VARIANVF-5 ms石英毛细管柱，柱起始温度60 ℃下保持2 min，然后以5 ℃/min的速度升温至120 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的速度升温至280 ℃；进样口温度280 ℃；载气为高纯He，载气流速1 mL/min，进样量1 μL，采用不分流方式进样；溶剂延迟3 min。

1.2.2.2 质谱条件。电离方式为EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，扫描质量范围30～500 amu。

1.2.2.3 检索谱库。对总离子流图中的各峰经过质谱计算机数据系统检索、Wiley L质谱库检索人工图谱解析和查对有关文献资料，结合质谱图中基峰、质荷比以及相对丰度与标准图谱的比较，各化学成分的相对含量按峰面积归一化法计算并确认[1]。

1.2.3 玉叶金花挥发油的总还原力测定。采用普鲁士蓝法[7]。

以滤膜过滤提取的挥发油作为母液。

取8支规格相同的10 mL加盖试管，向各试管中分别加入不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）的挥发油各2 mL，再加入0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.6）2.5 mL，随后加入质量分数1%的铁氰化钾2.5 mL，吸打混匀后放在50 ℃水浴锅中20 min，快速冷却后，再加入2.5 mL体积分数1%的三氯乙酸，混匀后，3 000 r/min离心10 min，吸取2.5 mL上清液放在新备的试管中，再向新试管中加入2.5 mL蒸馏水以及0.5 mL质量分数0.1%的三氯化铁，充分混匀，室温下静置10 min，在700 nm波长处测其吸光度并记录。

用VC做对照试验，分别进行3次平行试验，记录各次试验数据。

1.2.4 玉叶金花挥发油对DPPH·清除能力的测定。采用DPPH 法[7-11]。

称取20 mg DPPH，加适量95%乙醇使其溶解并定容于500 mL容量瓶中，避光保存待用。

取8支规格相同的10 mL加盖试管，取2 mL不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）的挥发油于试管中，加入2 mL配制好的DPPH溶液，充分吸打混匀，避光反应40 min后，在517 nm波长处测其吸光度，记为 Ai 。用95%乙醇溶液代替DPPH溶液，其他条件保持不变，在517 nm波长处测其吸光度，记为 Aj 。以95%乙醇溶液和DPPH溶液反应作为参照，其他条件保持不变，在517 nm波长处测其吸光度，記为 A0 。

用VC做对照试验，分别进行3次平行试验，记录各次试验数据。

清除率（K）=1-（Ai-Aj）/A0×100%

式中，Ai 为各样品溶液与 DPPH溶液混合液的吸光度；

Aj 为各样品溶液与95%乙醇溶液混合液的吸光度；

A0 为 DPPH溶液与95%乙醇溶液混合液的吸光度。

1.2.5 玉叶金花挥发油对超氧阴离子清除能力的测定。采用邻苯三酚自氧化法[7，12-13]。

取8支规格相同的10 mL加盖试管，取4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.2），置于25 ℃水浴20 min，分别加入不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）各1 mL及25 mmol/L邻苯三酚溶液0.5 mL，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，再加入1 mL 8 mol/L盐酸溶液终止反应，在425 nm波长处测其吸光度，记为 Ai 。以Tris-HCl作为参比，空白对照以蒸馏水代替样品，吸光度记为 Aj 。

用VC做对照试验，分别进行3次平行试验，记录各次试验数据。

清除率（K）=（Aj-Ai）/Aj×100%

式中，Ai 样品吸光度； Aj 为空白组吸光度。

1.2.6 玉叶金花挥发油对羟自由基清除能力的测定。采用Fenton体系产生·OH，水杨酸法检测羟基及样品清除·OH的能力的方法[12，14] 。

取1 mL不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）的挥发油，加入1 mL 9 mmol/L 硫酸亚铁溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，再加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，充分混匀，37 ℃水浴30 min，在510 nm波长处测其吸光度，记为 Ai ，取平均值。空白组以蒸馏水代替水杨酸，在510 nm波长处测其吸光度，记为 Aj 。对照组以1 mL蒸馏水代替挥发油溶液，在510 nm波长处测定吸光度，记为 A0 。

用VC水溶液代替样品做对照试验，分别进行3次平行试验，记录各试验数据。

清除率（K）=1-（Ai-Aj）/A0×100%

式中，Ai为样品吸光度；Aj为空白组吸光度；A0 为对照组吸光度。

1.2.7 玉叶金花挥发油对ABTS清除能力的测定[7，12，15]。

将20 mL 7 mmol/L ABTS和352 μL 140 mmol/L过硫酸钾混合，静置过夜14 h形成ABTS+储备液，用甲醇稀释成工作液[要求在30 ℃、734 nm波长处测得吸光度为（0.7±0.02）]，取0.1 mL不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）挥发油以及5 mL ABTS工作液，充分混匀，避光反应10 min，在734 nm波长处测其吸光度（ Ai ）。空白组用甲醇代替样品，测其吸光度（ A0 ） 。用甲醇代替ABTS 与样品反应，测其吸光度（ Aj ）。

用VC做对照试验，分别进行3次平行试验，记录各次试验数据。

清除率（K）=1-（Ai-Aj）/A0×100%

式中，Ai 为各样品溶液与ABTS溶液混合液的吸光度；

A0 为甲醇与ABTS溶液混合液的吸光度；

Aj 为各样品溶液与甲醇混合液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 玉叶金花叶中挥发油的提取率

在对玉叶金花挥发油的提取过程中，水浴时间为30 min，料液比为1∶15，蒸馏时间为6 h，得出玉叶金花叶中挥发油出油率为0.21%。

2.2 玉叶金花叶中挥发油化学成分分析

在对玉叶金花叶挥发油各成分的相对含量按峰面积归一化法计算并确认，其总离子流见图1。通过检测谱库并结合质谱图中基峰、质荷比以及相对丰度与标准图谱的比较，玉叶金花叶挥发油中共鉴定出有效成分49个组分（表1），占比为68.19%。其中，吡咯烷酮类占37.86%，饱和烷烃占12.35%，醇类化合物占9.22%，有机酸类占5.23%，酯类化合物占2.05%，烯烃类化合物占1.13%，酮类化合物占0.23%，其他化合物占0.12%，其中包括极具研究和应用价值的N-甲基吡咯（37.37%）、叶绿醇（7.34%）、角鲨烯（0.32%）、十六烷酸（4.83%）、亚油酸乙酯（0.43%）、二氢猕猴桃内酯（0.05%）。

2.3 玉叶金花挥发油的总还原力

由图2可知，随着玉叶金花挥发油浓度的增大，其总还原力也不断增大，溶液中挥发油含量与其抗氧化性呈正相关。与对照VC相比，当挥发油和VC的浓度（0.5～1.5 mg/mL）较低时，挥发油与VC的总还原力相当；随着浓度的增加，两者的总还原力都呈增大趋势，但挥发油总还原力增加的幅度低于VC。因此，在誤差允许的范围内，从整体来看，玉叶金花挥发油具有一定的抗氧化性，且其总还原力与VC的总还原力相当。

2.4 玉叶金花挥发油对DPPH·的清除能力

由图3可知，玉叶金花挥发油对DPPH·有一定的清除能力，而且这种清除能力在误差允许的范围内，随着挥发油浓度的升高呈不断提高的趋势。与对照相比较，VC对DPPH·的清除能力比挥发油对DPPH·的清除能力强，并且随着浓度的逐渐增大，清除率逐渐趋于稳定状态。另外，当挥发油浓度较低时，其清除能力远不及VC的清除能力，但当挥发油浓度逐渐升高，达到3.5 mg/mL左右时，挥发油对DPPH·的清除能力接近于VC的清除能力。

2.5 玉叶金花挥发油对超氧阴离子的清除能力

由图4可知，玉叶金花挥发油对超氧阴离子有清除作用，并且随着挥发油浓度的升高，清除能力不断增强。当挥发油浓度为0.5 mg/mL时，其清除率仅为63.9%；当浓度达3.5 mg/mL时，清除率达71.2%，作用效果极其明显。在对照试验中，VC对超氧阴离子的清除作用也随着VC浓度的升高而更加明显。

2.6 玉叶金花挥发油对羟自由基的清除能力

由图5可知，玉叶金花挥发油对羟自由基有一定的清除能力，并且随着挥发油浓度的升高，其清除效果越来越明显。当挥发油浓度为0.5 mg/mL时，清除率较低，随着浓度的升高，在误差允许的范围内，挥发油对羟自由基的清除能力总体呈逐渐增强趋势。在VC的对照试验中，在浓度低于1.5 mg/mL时，VC的清除效果比挥发油好，但随着浓度的升高，玉叶金花挥发油对羟基自由基的清除能力与VC相当。

2.7 玉叶金花挥发油对ABTS自由基的清除能力

由图6可知，挥发油对ABTS自由基有较好的清除效果，随着挥发油浓度的升高，清除效果越来越明显。且随着浓度的升高，挥发油ABTS的清除能力总体呈逐渐增强趋势。与VC的对照试验相比，在试验浓度范围内，玉叶金花挥发油对ABTS自由基的清除效果基本与VC相近。

3 结论与讨论

该研究主要采用水蒸气蒸馏法提取玉叶金花的挥发油，通过GC-MS分析了玉叶金花叶挥发油的化学组成，其中存在多种有益成分，如N-甲基吡咯可作为类风湿关节炎特效药物痛灭定的中间体，具有抑菌性，工业上也可作为防腐剂；叶绿醇不仅是动物机体氧化代谢的重要能量来源，而且还可以作为信号分子调控糖脂代谢、脂肪细胞分化[16]；叶绿醇还是合成VK及VE的原料[5]。

角鲨烯能从血液中摄取氧而活化成氧化鲨烯，改善、增强机体组织的生物氧化还原反应[10]，且具有抗氧化作用，能够保护细胞不受自由基侵害，在对小鼠癌细胞的研究中发现角鲨烯具有一定的抗癌性[11]；亚油酸乙酯能降低胆固醇和血脂，可预防或减轻脉粥样硬化症，目前临床上有亚油酸乙酯丸剂作为预防和治疗高血压及冠心病的药物[12]。

该研究显示，玉叶金花挥发油具有较好的体外抗氧化性，对自由基有一定的清除效果，且随着挥发油浓度的升高，清除效果呈不断增强的趋势，且在试验浓度范围内的高浓度区域，玉叶金花挥发油对羟基自由基和ABTS的清除能力都高于VC。

该试验研究了玉叶金花叶中挥发油化学成分的组成、含量和体外抗氧化的活性，为资源植物玉叶金花的综合开发利用，如作为天然抗氧化剂的来源应用于保健品、食品、化妆品等的开发利用提供了理论依据。

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