显齿蛇葡萄多糖的提取及鉴定

潘欣妍 佟长青 赵菲

摘要 [目的]研究张家界巴冲寨发酵型显齿蛇葡萄多糖的最佳提取条件。[方法]采用热水浸提、乙醇沉淀的方法，以提取时间、提取温度、料液比3个因素进行单因素及正交试验，对获得的显齿蛇葡萄多糖单糖组成进行分析。[结果]显齿蛇葡萄的多糖最佳提取条件为95 ℃、料液比为1∶40（g/mL）、提取1.0 h，显齿蛇葡萄多糖提取率为11.26%。单糖组成分析表明，显齿蛇葡萄多糖由Man、GlcUA、Glc、Gal、Xyl组成，Man/GlcUA/Glc/Gal/Xyl的摩尔比（%）为29/10/7/18/37。[结论]通过水提醇沉法可以获得显齿蛇葡萄多糖。

关键词 显齿蛇葡萄；多糖；提取；鉴定

中图分类号 TS201.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0148-03

Abstract [Objective]To study the optimum extraction conditions of a polysaccharide from Ampelopsis grossedentata in Bachong Village of Zhangjiajie.[Method]The polysaccharide was extracted using hot water and ethanol precipitation method. Single factor experiment and orthogonal test were investigated by taking extraction temperature， extraction time and solidliquid ratio. The monosaccharide composition of the polysaccharide was analyzed. [Result] The optimum conditions were as follows： 95 ℃，1∶40 solidliquid ratio（g/mL） and 1.0 h for extraction. The extraction rate of the polysaccharides was 11.26%. The polysaccharide from A. grossedentata was composed mainly of Man， GlcUA， Glc， Gal and Xyl. Its monosaccharide composition normalized mol（%）Man/GlcUA/Glc/Gal/Xyl was 29/10/7/18/37. [Conclusion] Polysaccharide was extracted from A. grossedentata by waterethanol fractional precipitation method.

Key words Ampelopsis grossedentata；Polysaccharide；Isolation；Characterization

顯齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）是葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物，主要分布于湖南、湖北、江西、福建、广东、广西、云南、贵州等地[1]。它具有清热解毒、祛风湿等功效。民间将其嫩茎叶制成保健茶来治疗感冒发烧、喉咙肿痛、黄疸型肝炎、疱疖等症，已有数百年的应用历史[2]。显齿蛇葡萄的嫩叶经过杀青、揉捻、烘干而成的类茶饮料称为藤茶、茅岩莓茶。藤茶为药食两用植物，加工的产品有藤茶饼、袋泡茶、速溶茶、含片以及果冻等[3-5]。

对于显齿蛇葡萄的药理活性部位，人们进行了大量深入的研究。显齿蛇葡萄含有较多的黄酮类物质及多酚类化合物，而水溶性多糖及水溶性蛋白含量相对较少[6]。研究表明，多糖是药源生物的重要活性物质。人们在显齿蛇葡萄多糖方面也进行了大量研究。邹艳梅等[7]研究了热水浸提法提取显齿蛇葡萄多糖的工艺，目的是确定采用最佳工艺提取不同时期显齿蛇葡萄茎、叶多糖含量，8月份湖南怀化市的显齿蛇葡萄茎、叶多糖含量分别为1.41%、2.79%。肖浩等[8]研究了响应面法优化“白露”发酵型藤茶黄酮和多糖的提取工艺，在提取温度96 ℃、时间1.6 h、料液比1∶21（g/mL）的最优条件下，总黄酮和多糖的提取率分别为22.94%和213%。王岚等[9]采用超声提取法对梵净山野生藤茶多糖进行提取，结果表明在料液比为1∶20（g/mL）、70%乙醇、温度70 ℃以及提取时间50 min的最佳工艺条件下，藤茶多糖提取率为4.08%。熊伟等[10]采用热水浸提法对江西抚州黎川产藤茶中二氢杨梅素和多糖进行了同步提取，在提取温度90 ℃、提取时间120 min、料液比1∶20的最佳工艺条件下，二氢杨梅素和多糖提取率分别为21.86%和5.74%。由此可见，不同产地、不同季节的显齿蛇葡萄，其多糖提取率不同。笔者提取分离并初步鉴定了张家界巴冲寨发酵型显齿蛇葡萄的多糖，以期为显齿蛇葡萄的开发利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料。茅岩莓茶，产于我国张家界巴冲寨。

1.1.2

试剂。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、D-甘露糖（D-Man）、D-岩藻糖（D-Fuc）、D-鼠李糖（D-Rha）、D-葡萄糖（D-Glc）、葡萄糖醛酸（D-GlcUA）、D-木糖（D-Xyl）、D-半乳糖（D-Gal）及三氟乙酸（均为分析纯），购于上海医药集团；乙腈（色谱纯），购于Fisher公司。

1.1.3

仪器。HH-S型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）；GL21M型低温冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；UV-1750型紫外可见分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]；FD-1型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.2 方法

1.2.1 显齿蛇葡萄多糖提取。采用热水浸提方法提取显齿蛇葡萄多糖。每次取干燥显齿蛇葡萄叶10 g，分别在一定时间、一定温度、一定料液比下进行热水浸提，抽滤得滤液。向滤液中加入4倍滤液体积的95%乙醇进行沉淀。室温下静置12 h后在4 000 r/min条件下离心20 min，沉底用少量的蒸馏水溶解，冷冻干燥。

1.2.2

显齿蛇葡萄多糖含量测定。显齿蛇葡萄多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。

1.2.3

单糖组成分析。称取20 mg显齿蛇葡萄多糖放于安瓿瓶中，再加入4 mL的4 mol/L三氟乙酸。吹氮气封口，烧结，在120 ℃下水解4 h之后，加入4 mL的4 mol/L NaOH溶液中和，即得到显齿蛇葡萄多糖水解液。

取5 mg/mL甘露糖（Man）、岩藻糖（Fuc）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、葡萄糖醛酸（GlcUA）作为标准单糖。将200 μL标准单糖溶液、显齿蛇葡萄多糖水解液置于干净的试管中，再分别加入100 μL的0.5 mol/L NaOH溶液及100 μL的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）溶液（以甲醇溶解配制成0.5 mol/L溶液）。70 ℃水浴1 h后加入100 μL的0.5 mol/L HCl中和，再加入0.9 mL三氯甲烷溶液，漩涡振荡，彻底混匀。在8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，重复3次。

取20 μL以PMP标记的单糖溶液或者样品溶液通过C18柱（4.6 mm×150 mm）在HPLC上进行分析。以溶剂A：含10%乙腈的0.1 mol/L pH 6.0的PB缓冲液，溶剂B：含25%乙腈的0.1 mol/L pH 6.0的PB缓冲液作为流动相。时间梯度：0 min—10 min—20 min—40 min—50 min，相对应的浓度为25%—50%—75%—90%—100%的溶剂B，流速为1 mL/min，设定紫外检测波长为245 nm[11]。

1.2.4

红外光谱（FT-IR）分析。取150 ℃下干燥3 h的溴化钾药品0.2 g，与0.002 g干燥的显齿蛇葡萄多糖混合于玛瑙研钵内。研细混合均匀，转至模具中，在压力为30～40 mPa下进行压片，再将制好的压片置于样品架上，在波数400～4 000 cm.-1下进行红外扫描。

2 结果与分析

2.1 显齿蛇葡萄多糖提取

2.1.1

提取温度。由图1可知，多糖提取率随温度的升高而升高，在95 ℃时提取率最高，95 ℃之后提取率有缓慢下降的趋势，故95 ℃为显齿蛇葡萄多糖最佳提取温度。

2.1.2

提取时间。由图2可知，多糖提取率随提取时间的增加而升高，在提取时间为1.5 h时提取率最高，而后呈缓慢下降趋势，故显齿蛇葡萄多糖提取的最佳时间为1.5 h。

2.1.3

料液比。由图3可知，在料液比1∶45（g/mL）条件下提取率最高，故显齿蛇葡萄多糖提取的最佳料液比为1∶45（g/mL）。

2.1.4

正交试验结果。根据上述单因素试验结果，以显齿蛇葡萄多糖提取率为指标，开展提取温度、料液比和提取时间三因素三水平正交试验L9（3.3），正交试验因素及水平见表1，正交试验结果见表2。

由表2可知，各因素对显齿蛇葡萄多糖的提取工艺影响程度从大到小依次为B、A、C，即提取时间、提取温度、料液比。A2B1C2为最佳工艺，即提取温度95 ℃、提取1.0 h、料液比为1∶40（g/mL）为最佳提取条件。在最佳提取条件下，显齿蛇葡萄多糖提取率为11.26%。这一多糖提取率远高于文献报道的显齿蛇葡萄多糖提取率[7-10]。

2.2 化学组成

HPLC结果表明，单糖出峰次序依次为Man、Rha、GlcUA、Glc、Gal、Xyl、Fuc（图4A），显齿蛇葡萄多糖由Man、GlcUA、Glc、Gal、Xyl组成（图4B）。显齿蛇葡萄多糖Man/GlcUA/Glc/Gal/Xyl的摩尔比（%）为29/10/7/18/37。HPLC单糖组成分析结果与罗祖友等[12]研究结果类似，都表明显齿蛇葡萄多糖中含有GlcUA。

2.3 红外光谱分析结果

由图5可知，在3 376 cm.-1处为-OH的伸缩振动吸收峰；2 919、2 850 cm.-1處为C-H的伸缩振动吸收峰；1 652 cm.-1处为COO-的伸缩振动吸收峰；1 421、1 373 cm.-1处为-CH2的变型吸收峰；1 326 cm.-1处为C-H弯曲振动吸收峰；1 253、1 205 cm.-1处为2种C-O伸缩振动引起的；1 151 cm.-1处为C-O吸收峰；1 083、1 031 cm.-1处为-OH的变角振动吸收峰。

3 结论

利用热水浸提、乙醇沉淀的方法从张家界巴冲寨发酵型显齿蛇葡萄中提取出了多糖。以提取时间、提取温度、料液比3个因素进行单因素及正交试验结果表明，显齿蛇葡萄的多糖最佳提取条件为95 ℃、料液比为1∶40（g/mL）、提取1.0 h。在最佳提取条件下，显齿蛇葡萄多糖提取率为11.26%。单糖组成分析表明，显齿蛇葡萄多糖由Man、GlcUA、Glc、Gal、Xyl组成，Man/GlcUA/Glc/Gal/Xyl的摩尔比（%）为29/10/7/18/37。

参考文献

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[10] 熊伟，王慧宾，李雄辉，等.热水浸提法同步提取藤茶中二氢杨梅素和多糖的工艺研究[J].生物化工，2015，1（1）：5-6，11.

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[12] 罗祖友，程超，李伟，等.藤茶水溶性多糖的分离纯化及性质的研究[J].食品科学，2007，28（1）：151-154.