霍山石斛多糖的半仿生提取工艺优化与抗炎活性评价

戴玮 罗建平

摘要 [目的]优化霍山石斛多糖的半仿生提取工艺，并评价所提多糖的抗炎活性。[方法]以多糖得率为指标，采用单因素试验和正交试验方法对提取工艺进行优化，以LPS诱导的RAW264.7细胞为体外炎症模型，评价多糖的抗炎活性。[结果]半仿生提取法最佳工艺条件为：料液比1∶30、提取温度80 ℃、模拟胃液提取时间1.5 h、模拟肠液提取时间 2.5 h，在此条件下多糖的得率为（60.9±1.2） mg/g，较传统水提法的多糖得率提高16.55%。细胞试验表明，霍山石斛多糖能抑制RAW264.7细胞NO及IL-1β的分泌，降低iNOS和IL-1β mRNA的表达。[结论]优化后的提取工艺合理可行，提取率高，所提多糖的抗炎活性优于传统方法制备的多糖。

关键词 霍山石斛多糖；半仿生提取法；抗炎活性

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0151-04

Abstract [Objective]The semibionic extraction technology of Dendrobium huoshanense polysaccharides was optimized and the antiinflammatory activity of polysaccharides was evaluated.[Method]Single factor and orthogonal experiments were used to optimize the extraction technology based on polysaccharide yield.LPSinduced RAW264.7 macrophages were used to determine the antiinflammatory activity of polysaccharides.[Result]The optimal conditions of semibionic extraction were solidliquid ratio of 1∶30，extraction temperature of 80 ℃，stimulated gastric fluid extraction time of 1.5 h and simulated intestinal fluid extraction time of 2.5 h.Under the optimized conditions，the yield of polysaccharides was （60.9±1.2 ）mg/g，which was increased by 16.55% as compared to the traditional water extraction technology.Cell experiments showed that the polysaccharides obtained by semibionic extraction technology could effectively inhibit the secretion of NO and IL1β from RAW264.7 cells and reduce the mRNA expression of iNOS and IL1β in RAW264.7 cells.[Conclusion] The optimized technology is reasonable and feasible，its extraction ratio is high，and the extracted polysaccharides from Dendrobium huoshanense has better antiinflammatory activity than that of the polysaccharides prepared by water extraction.

Key words Dendrobium huoshanense polysaccharides；Semibionic extraction；Antiinflammatory activity

霍山石斛是安徽省特有的传统名贵中药材，药食两用历史悠久。大量研究表明，多糖是霍山石斛的主要活性成分，对与高血糖、高血压、高血脂、肥胖症、脂肪肝等慢性代谢性疾病相关的炎性免疫具有调节功能[1-2]，可有效改善身体健康状况。植物多糖提取多采用水提醇沉法，提取耗时且提取率不高[3]。采用半仿生提取法提取霍山石斛多糖，不仅具有生产成本低、易于放大、操作过程绿色安全等优点，而且提取的多糖符合霍山石斛的使用习惯，可为霍山石斛的开发和利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与主要试剂。霍山石斛原球茎由合肥工业大学中草药与功能食品研究所提供。胎牛血清（北京索莱宝科技有限公司）、0.25%胰蛋白酶溶液、青霉素链霉素溶液-双抗（GIBCO公司）、DMEM培养基（Thermo Fisher 公司）、cDNA逆转录试剂盒（Thermo公司）、Mouse IL-1β试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）、NO试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。其余试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器。Hei-VAP Advantage旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；SHZ-D循环水式真空泵（巩义市英予华仪器厂）；CT15RT高速冷凍离心机（上海天美科学仪器有限公司）；1260 Infinity高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Vl100可见光分光光度计（上海美普达仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 霍山石斛多糖半仿生法提取工艺的优化。

1.2.1.1 单因素试验。

精密称取霍山石斛粉末1.0 g，在不同料液比、提取温度和提取时间下用模拟胃液提取[4]，提取液离心，上清液为模拟胃液提取液，沉淀溶于模拟肠液[4]，在不同料液比、提取温度和提取时间下提取，提取液离心取上清，得到模拟肠液提取液。当考察单因素对多糖得率的影响时，其余因素固定，固定条件为：料液比1∶30、提取温度60 ℃、提取时间1.5 h。分别选取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，提取温度40、50、60、70、80、90、100 ℃，提取时间1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h进行单因素试验。多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，多糖得率（mg/g）以干重材料提取的多糖质量表示。

1.2.1.2 正交试验。设置因素水平编码表，利用设计正交试验研究料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）3个因素对各个指标的影响。模拟胃液和模拟肠液提取正交试验因素水平编码分别见表1和表2。

1.2.1.3 霍山石斛多糖半仿生提取的应用。

半仿生提取法：精密称取霍山石斛原球茎粉末1.0 g，溶解于30 mL模拟胃液中，在80 ℃条件下提取1.5 h，提取液离心，上清液为模拟胃液提取液，沉淀溶于30 mL模拟肠液中，在80 ℃条件下提取2.5 h，提取液离心取上清，得到模拟肠液提取液，合并提取液得到半仿生法提取液，测定并计算其多糖得率。

传统水提法：精密称取霍山石斛原球茎粉末1.0 g，溶解于30 mL蒸馏水中，在100 ℃条件下提取2 h，提取次数2次，离心取上清液，得到霍山石斛水提法提取液，测定并计算其多糖得率。

1.2.2 霍山石斛多糖的理化性质分析。

传统水提法和半仿生提取法提取的霍山石斛粗多糖经阴离子交换树脂纯化，分别得到传统水提法制备的多糖（DHP-1）和半仿生提取法制备的多糖（DHP-2）。

采用高效凝胶渗透色谱法[5]检测多糖的分子量。样品浓度为5 mg/mL，上样量为20 μL，色谱条件：Agilent 1260 Infinity系统，示差折光检测器，TSK G5000 PWxl（7.8×300 mm）和TSK G4000 PWxl（7.8×300 mm）色谱柱，双蒸水流动相，柱温30 ℃，流速0.5 mL/min。多糖的重均分子量和数均分子量由Agilent GPC软件计算获得。

多糖的特性黏度[η]用乌氏粘度计测定[6]，测定条件为：温度（30.0±0.1）℃、样品浓度1.0 mg/mL。

多糖的单糖组成采用PMP柱前衍生化HPLC法测定[7]，测定条件是：上样量20 μL；色谱柱，Agilent XDB-C18柱（250 mm，4.6 nm，0.5 μm）；流动相，乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液（20∶80，V/V）；流速，1 mL/min；柱温，25 ℃；检测波长，250 nm。

1.2.3 霍山石斛多糖的抗炎活性测定

1.2.3.1 霍山石斛多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO和IL-1β释放的影响。

设置对照组、LPS组、LPS+不同多糖组，除对照组不加LPS外，其他组均加入终浓度为1 μg/mL的LPS溶液。细胞于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后，先与多糖共培养2 h，再加入LPS培养24 h。培养结束后，4 ℃、1 000 r/min离心10 min取上清培养液，分别用试剂盒测定NO和IL-1β含量，具体方法参照各试剂盒标准操作程序。考察的多糖浓度为25、50、100、200、400 μg/mL，考察的细胞密度为1×10.5、5×10.5、1×10.6个/mL。

1.2.3.2 霍山石斛多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和IL-1β mRNA表达的影响。

取对数生长期的RAW264.7细胞，调整

细胞密度为5×10.5个/mL后置于24孔板培养24 h，分别加入不同浓度多糖（终浓度分别为25、50、100、200、400 μg/mL）培养2 h，再加入终浓度为1.0 μg/mL的LPS，培养24 h后提取细胞RNA，用Thermo反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以GAPDH为内参采用RT-PCR技术进行扩增。GAPDH引物是5-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3和3-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-5，iNOS引物是5-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3和3-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTG-5，IL-1β引物是5-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3和3-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-5。扩增条件为：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火及聚合60 s，扩增循環35次。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0和Origin 9软件对数据进行分析和作图，所有试验至少重复3次。P<0.05表示差异显著（*），P<0.01表示差异极显著（**）。

2 结果与分析

2.1 半仿生提取工艺的优化

模拟胃液提取单因素试验结果见图1。当固定提取温度为60 ℃、提取时间为1.5 h时，料液比在1∶10～1∶50多糖得率呈先增大后减小的趋势，料液比为1∶30时多糖得率最高（图1a）。在料液比为1∶30、提取时间为1.5 h条件下，提取温度在40～100 ℃，多糖得率随着提取温度的升高而逐渐增大，但80 ℃后有减小趋势（图1b）。当料液比为1∶30、提取温度为60 ℃时，多糖得率在提取时间为2.0 h时达到最大，其后呈现下降的趋势（图1c）。

模拟胃液中料液比、提取温度、提取时间的正交试验表明（表3），以多糖得率为优化指标，表中最优组合为A3B2C1，极差分析所得的最优组合为A2B2C1。对2种组合进行验证，A2B2C1组多糖得率为54.702 mg/g，A3B2C1组多糖得率为53.427 mg/g。因此，选择A2B2C1组，即料液比1∶30、提取温度80 ℃、提取时间1.5 h作为模拟胃液提取部分的最优工艺条件。

模拟肠液提取单因素试验结果见图2。在提取温度为60 ℃、提取时间为1.5 h条件下，料液比在1∶10～1∶50多糖得率先上升后降低，当料液比为1∶30时多糖得率高（图2a）。当固定料液比为1∶30、提取时间为1.5 h时，多糖得率随提取温度的升高而提高，至80 ℃时最大，随后呈下降趋势（图2b）。在料液比为1∶3、提取温度为60 ℃条件下，多糖得率在提取时间为2.5 h时最大（图2c）。

模拟肠液中料液比、提取温度、提取时间的正交试验表明（表4），表中第6组A2B3C1的多糖得率最高，而极差分析得到的最优组合为A2B2C2。经验证，A2B2C2组多糖得率为22.556 mg/g，A2B3C1组合的多糖得率为22.315 mg/g。因

此，选择A2B2C2组合，即料液比1∶30、提取温度80 ℃、提取時间2.5 h作为模拟肠液提取部分的最优工艺条件。

采用上述优化的模拟胃液和模拟肠液提取条件组成的半仿生提取法提取霍山石斛多糖，多糖的得率可以达到（60.9±1.2） mg/g，而传统水提法的多糖得率仅仅为（42.9±1.3） mg/g，半仿生提取法较传统水提法多糖得率提高了16.55%。

2.2 霍山石斛多糖的理化性质分析

由表5可知，半仿生法提取的多糖（DHP-2）与传统水提法提取的多糖（DHP-1）的数均分子量（Mn）相差不大，但DHP-2的重均分子量（Mw）要明显高于DHP-1的重均分子量，表明DHP-2物理性质与相对分子质量大的多糖组分关系更大。2种多糖多分散性系数d值均不为1，且DHP-2的d值更大，说明2种多糖都不是均一组分，DHP-2的多糖分子量分布更宽。单糖组成分析结果表明，DHP-1和DHP-2均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，但它们的组成比例不同。可见半仿生法提取的多糖在理化性质方面与传统水提法提取的多糖差异明显。

2.3 霍山石斛多糖抗炎活性的分析

2.3.1 霍山石斛多糖对RAW264.7细胞NO、IL-1β释放的影响。LPS能刺激RAW264.7细胞过量分泌炎症因子NO及IL-1β[8]。设置地塞米松（dex）为阳性对照，当DHP-1和DHP-2浓度在25～200 μg/mL时，多糖对NO和IL-1β的抑制率随多糖浓度的增加而提高，当多糖浓度为400 μg/mL时，多糖对NO和IL-1β的抑制率略微下降（图3）。结果表明，半仿生法制备的多糖与传统水提法制备的多糖均能抑制炎性因子NO及IL-1β的过量表达，相比而言，DHP-2抑制炎性因子分泌的效果要优于DHP-1。

2.3.2 霍山石斛多糖对RAW264.7细胞iNOS、IL-1β mRNA表达的影响。

由图4可知，当DHP-1和DHP-2浓度在25～200 μg/mL时，iNOS和IL-1β的mRNA相对表达量随着多糖浓度的升高而降低，当多糖浓度为400 μg/mL时，iNOS和IL-1β的mRNA相对表达量略微增加。结果表明，半仿生提取法制备的多糖与传统水提法制备的多糖在试验浓度范围内均能降低iNOS及IL-1β mRNA的表达量，相比而言，DHP-2抑制iNOS和IL-1β mRNA表达的效果要优于DHP-1。

3 结论

半仿生法提取霍山石斛多糖，多糖得率为（60.9±1.2） mg/g，提取效率可比传统水提法提高16.55%。由于提取工艺不同，半仿生法提取的多糖与传统水提法提取的多糖具有不同的理化性质，两者的分子量分布和单糖组成比例不同。抗炎活性评价分析显示，半仿生法提取的多糖与传统水提法提取的多糖均能抑制RAW264.7细胞NO及IL-1β的分泌，降低iNOS和IL-1β mRNA的表达，但半仿生法提取的多糖其抗炎活性要优于传统水提法提取的多糖。结果表明，采用半仿生法提取霍山石斛多糖，不仅可以提高多糖得率，还可提高多糖的抗炎活性。

参考文献

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