结缕草属植物种质资源遗传变异研究

黄春琼 刘国道 白昌军 唐军 王文强 丁西朋 刘一明

摘 要 利用SRAP标记技术研究45份结缕草属植物的遗传变异情况。从100对引物中筛选出13对扩增带型清晰、多态性较好的引物对其进行扩增，共扩增出113条条带，平均每对引物扩增出8.69条条带，多态性条带数为96条，多态性条带所占比例为84.16%，遗传相似性范围为0.54～0.96，平均为0.75。基于UPMAG（unweighted pair-group method with arithmetic means）法，在遗传相似性系数为0.74时，可将45份结缕草属种质分为4个类群，生态地理条件相似的种质优先聚在一起。本研究结果说明结缕草属植物种质间遗传变异比较广泛，为结缕草属植物种质资源的开发利用及新品种选育奠定了良好基础。

关键词 结缕草；遗传变异；SRAP

中图分类号 S544+.2 文献标识码 A

Abstract Sequence-related amplifed polymorphism （SRAP） was used to detect the genetic variation and genetic ralationship among 45 Zoysia willd. accessions. A total of 13 primer pairs from the original 100 primer pairs were selected based on the polymorphic， clear and reproducible bands produced by them among 3 Zoysia accessions. A total of 113 bands were amplified by 13 SRAP primer pairs from 45 Zoysia accessions， and 96 （84.16%） out of them were polymorphic. The genetic similarity coeffcients （GSC） among the 45 accessions ranged from 0.54 to 0.96 with an average of 0.75. Cluster analysis conducted by the unweighted pair-group method with arithmetic averages （UPGMA） separated the 45 Zoysia accessions into 4 distinct groups when the genetics similarity coefficient was 0.74. Results obtained clearly indicated significant variation existed in the wild Zoysia genotypes， which would provide a theoretical foundation for development and utilization of Zoysia germplasm resources and new variety breeding.

Keywords Zoysia； genetic varation； SRAP

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.001

結缕草属（Zoysia willd.）隶属于禾本科（Gramineae）、画眉草亚科（Chloridoideae）多年生低矮草本植物，主要分布在东亚、东南亚以及澳大利亚等。结缕草属一般分为11个种、多个变种以及变型[1-4]，其中大多数结缕草可用于运动场草坪、休憩草坪及保土草坪等的建植。结缕草属植物在我国分布有5个种、2个变种和1个变型，是该属中目前作为草坪种质资源研究和开发利用的主要种。5个种分别是结缕草（Z. japonica Steud.）、细叶结缕草（Z. tenuiflia willd.ex Trin.）、沟叶结缕草（Z. matrella （L.） Merr.）、大穗结缕草（Z. macorostachya Franch.et Sva.）以及中华结缕草（Z. sinica Hance）；2个变种分别是青结缕草（Z. japonica var. pollida Nakai et Honda）和长花结缕草（Z. sinica var. nipponica Ohwi.）；1个变型是大穗日本结缕草（Z. japonica f. macrostachya H. D. Dung et L. J. Gong）[5]。其中结缕草是该属中分布范围最广、应用面积最大的一个种，也是中国结缕草属的代表种[6]。中国的野生结缕草属种质资源丰富，分布地域广泛，北起辽宁东部，南至福建南部，东起吉林省鸭绿江中上游，西到陕西东南部，包括我国东南部辽宁、山东、河北、河南、陕西、湖北、江西、安徽、江苏、浙江及福建共11个省[7]。

近年来，分子标记技术在草坪草种质资源的研究中的应用越来越广泛。在结缕草属植物的研究中也有广泛的应用。如限制片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[8]、随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）[9-11]、扩增片段长度多态性（amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）[12-13]、DNA简单序列重复（simple sequence repeats，SSR） [14-17]、表达序列标签（expressed sequence tags，EST-SSR）[18]、简单序列重复区间扩增（inter-simple sequence

repeat，ISSR）[19]标记已应用在亲缘关系的鉴定、遗传多样性分析、指纹图谱及遗传连锁图谱的构建等。这些标记各有优缺点，相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）[20]的出现弥补了以上分子标记的不足并且呈现出许多优越性，该标记具有扩增简便稳定、重复性好、多态性高并且不依赖于基因组序列等优点。目前已应用于植物的遗传多样性、遗传图谱的构建等研究中[21-23]。在结缕草种质资源遗传多样性的研究中，郭海林等[24]的研究表明了SRAP应用在结缕草属种质资源遗传多样性研究上的优越性和有效性。基于SRAP分子标记的诸多优越性，本研究采用SRAP分子标记的方法对不同地理来源的结缕草属种质进行遗传变异研究，从分子水平上探讨了结缕草种质资源的遗传多样性，为结缕草属种质资源的研究奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料选取2004—2008年从山东、江苏、浙江、安徽、上海以及福建等地采集的45份结缕草属野生种质资源，材料来源详见表1。其中，

包括中华结缕草1份（江苏）、沟叶结缕草2份（福建）、结缕草42份（江苏12份，山东19份，浙江6份，安徽4份，上海1份），这些材料均保存于海南省儋州市中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所草业研究室试验基地。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取及检测 参考黄春琼等[25]利用改良CTAB法提取3种暖季型草坪草基因组DNA的方法提取基因组DNA。提取产物经琼脂糖凝胶电泳以及核酸蛋白含量仪测定后，筛选出符合实验要求的样品保存于–20℃冰箱。

1.2.2 SRAP-PCR分析 本研究所使用引物序列与Huang等[26]所用的序列一致，以3份结缕草（Z14、Z35和Z41）的DNA作为模板进行引物筛选，筛选在3份材料间有多态性条带、扩增稳定且带型清晰的引物，然后利用筛选出的引物对45份结缕草属种质进行SRAP-PCR扩增分析。本研究所使用的反应体系、扩增程序及扩增产物的检测与Huang等[27]的一致。

1.3 数据处理

SRAP-PCR扩增条带以0，1建立数据库。同一对引物，同一个位点上能扩增出条带的记为1，

没有该条带的记为0，形成0，1矩阵数据库，利用NTSYS2.10e软件计算种质间的遗传相似系数。同时利用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA）对种质进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA质量的检测

结缕草属种质基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。从图1可以看出，扩增条带清晰明亮、带型整齐干净，无其他杂带，无拖尾现象，说明所提取的DNA质量较好，DNA完整无降解。经核酸蛋白分析仪检测，A260/A280在1.8～2.0，表明酚类、多糖等杂质去除较好，符合实验要求。

2.2 引物的筛选

从100对SRAP引物中共筛选出了13对多态性和稳定性良好的引物（表2）。部分引物筛选情况如图2所示，图2中所用的引物依次是M6E2、M5E2、M4E2、M3E2、M2E2、M1E2和M10E2。从图2中可以看出，引物M5E2和M3E2分别在600、450 bp处在3份结缕草种质中扩增出多态性条带（箭头所示）。

2.3 SRAP-PCR扩增多态性分析

利用上述筛选出的13对SRAP引物对45份结缕草属种质进行扩增，扩增结果如表3所示。从表3中可以看出，共扩增出113条条带，平均每对引物扩增获得8.69条带，其中多态性条带为96条，多态性比例为84.16 %，由此可以看出，SRAP标记揭示结缕草属植物的多样性效率是比较高的。扩增条带数最多的引物为M9E5，扩增条带数为12条，扩增条带数最少的引物是M1E2，扩增条带数为6条。图3为引物M2E10对45份结缕草种质扩增的电泳图，从图中可以看出，扩增带型比较清晰，多态性丰富。

2.4 遗传相似性分析

经NTSYS软件计算得出45份结缕草属种质间的遗传相似性系数范围为0.54～0.96，平均值为0.75。从遗传相似系数矩阵（略）可以得知，在45份结缕草属种质中，来自山东东营的Z13和山东泰安的Z14号的遗传相似系数最大，为0.96，表明这2个种质间的亲缘关系较近，遗传变异最小；来自浙江象山的Z21和安徽肥東的Z37的遗传相似系数最小，为0.54，表明它们之间的亲缘关系较远，遗传变异最大。

2.5 聚类分析

基于各种质间的遗传相似性系数，利用UPGMA法对45份结缕草属种质进行聚类分析，聚类分析结果如图4所示。从图4中可以看出，在遗传相似性系数为0.74时，可将45份结缕草属种质明显分为4个类群。第1类群包括8份种质，其中结缕草6份、沟叶结缕草2份（来自福

建的Z35和Z36），来自江苏盐城的Z21与其他7个种质的亲缘关系较远，而来自江苏盐城河边的Z11与江苏东台海边的Z12亲缘关系较近。第2类群仅包括1份浙江衢州田边采集的结缕草Z18。第3类群包括24份种质，其中中华结缕草（Z02）1份、结缕草23份，来自山东东营路边的Z13和山东泰安山坡的Z14的亲缘关系最近，引物组合M9E5可将其区分开，而来自山东临沂路边的Z19与安徽蚌埠淮河边的Z16亲缘关系较远。第4类群包括12份结缕草种质，其中来自山东烟台水边的Z24与江苏南通水边的Z39的亲缘关系较远，而来自浙江仙居谷地的Z06与浙江龙游田边的Z09的亲缘关系较近。

3 讨论

关于结缕草种质资源的遗传多样性研究，前人在形态学方面的研究结果表明中国结缕草属植物在形态上存在着丰富的遗传变异[28-30]。在分子方面也有相关报道，金洪[5]利用AFLP标记对中国结缕草种质资源自然分布区的19个野生居群和1个栽培居群进行了生态学特性和居群变异研究，10对AFLP引物共扩增出524条清晰的条带，其中多态性条带为385条，多态性比例为73.50%，从DNA水平上显示出结缕草具有丰富的遗传多样性。赵岩等[18]利用EST-SSR验证其在结缕草中的通用性，结果显示9份参试材料扩增出丰富的多态性，多态性比例为91.38%。以上这些研究仅针对结缕草属的1个种进行遗传变异研究。本研究通过SRAP分子标记技术对涵盖了我国主要分布和应用区域的结缕草属植物的3个种（结缕草、沟叶结缕草和中华结缕草）的遗传多样性进行研究，结果显示13对引物能扩增出113条条带，其中多态性条带为96条，多态性比例为84.16%，种质间的遗传相似性变异范围较大，为0.54～ 0.96，在分子水平上说明了我国结缕草属植物种质资源间存在丰富的遗传变异，同时也证实了利用SRAP标记技术对结缕草属植物的多样性及种内关系进行研究是有效的。

本研究在对结缕草属植物进行聚类分析发现，生态地理条件来源相似的种质优先聚在一起，如Z13（山東东营路边）和Z14（山东泰安山坡）的亲缘关系最近，因为都在山东省内的草地采集，种群数量较多，发生遗传变异的概率较小。这一研究结果与宣继萍等[31]利用SSR标记研究结缕草属的9种1变种共58份材料的研究结果一致，聚类分析结果同样表明生态地理条件相似的种优先聚在一起。另外，来自浙江衢州的Z18单独聚为1类，与其他结缕草的遗传基础差异较大，亲缘关系较远，这份材料的形态特征与其他结缕草相比并没有特别的区别特征，但可能在遗传物质上确实存在一些特异的基因。这一现象与郭海林等[24]的研究结果一致。此外，本研究通过SRAP分子标记技术对结缕草属植物的3个种的遗传变异进行研究，未能将沟叶结缕草（Z35和Z36）、中华结缕草（Z02）和结缕草（42份）从种间明显区分开。这一现象前人也有相关报道。郭海林等[24， 32]分别利用SRAP和SSR标记对结缕草属植物5种1变种共96份种质进行遗传多样性分析时也发现结缕草、中华结缕草和沟叶结缕草存在交叉聚类现象，同一个种并非完全聚在一类。这可能和收集的种质数量及所用引物有关，本研究使用的是沟叶结缕草2份、中华结缕草1份、结缕草43份。后期研究可以继续多筛选一些引物或者结合其他分子标记进行分析，看能否将这几个种明显区分开。本研究结果显示结缕草属种质间具有丰富的遗传多样性，为狗牙根种质资源后续研究奠定了良好的基础。

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