支气管哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠综合征患者呼出气冷凝液和血清8⁃isoPG 、MPO 、LTB4、IL⁃6的测定及临床意义

熊小明 童国强 付云杰 陈雪礼 项琪 计玉冰 程瑞明

九江市第一人民医院1呼吸内科，2检验科（江西九江 332000）

支气管哮喘⁃慢性阻塞性肺疾病重叠综合征（ACOS）患者在气道炎症特点、气道重塑、临床特征等诸多方面既有支气管哮喘（简称哮喘）特征、又有慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）特征［1］；目前ACOS发病机制尚不明确；最近研究表明ACOS患者气道炎症具有不同的特性：吸烟的哮喘患者的气道中可见类似于慢阻肺的嗜中性粒细胞升高［2］；另一方面在慢阻肺患者气道中观察到TH2细胞介导的炎症反应和嗜酸性粒细胞的导致的炎症反应［3］。近年来发现呼出气冷凝液（EBC）检测得到的生化标志物可以反映患者气道的氧化应激或炎症状态［4］；笔者选择8-异前列腺素（8⁃isoPG）、髓过氧化物酶（MPO）、白三烯B4（LTB4）、白介素⁃6（IL⁃6）等能较好反映系统及气道炎症水平和氧化应激程度的炎症因子，检测它们在ACOS患者EBC和血清中的水平并与哮喘、慢阻肺进行比较分析，了解EBC、血清中炎症因子对ACOS患者的临床意义，以及探寻可能鉴别ACOS的生物标志物，为个体化的临床诊疗提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 对象 随访2015年6月至2017年03月在我院呼吸科门诊或住院诊治的慢性气道炎症性疾病患者，进入稳定期（或缓解期）后纳入临床实验，共64例；其中ACOS组病例18例，男11例，女7例，平均（65.2±10.5）岁，吸烟指数（28.6±22.5）年包，体质指数（20.3± 2.1）kg/m2，肺功能 FEV1（1.2±0.5）L；哮喘组22例，男10例，女12例，平均（55.3±11.2）岁，吸烟指数（18.2±7.5）年包（吸烟及曾经吸烟者9人），体质指数（20.8± 1.5）kg/m2，肺功能FEV1（2.3± 0.6）L；慢阻肺组24例，男15例，女9例，平均（69.1±11.5）岁，吸烟指数（32.1±25.3）年包，体质指数（19.2± 1.8）kg/m2，肺功能FEV1（32.1±25.3）L；同期肺功能正常的健康非吸烟体检者约20例为对照组（非吸烟为从未吸烟者），男9例，女11例，平均（57.3±11.8）岁，体质指数（21.1± 2.0）kg/m2，肺功能FEV1（2.8 ± 0.7）L。哮喘、慢阻肺诊断参照我国慢性阻塞性肺疾病诊治指南［5］，支气管哮喘防治指南诊断标准［6］；ACOS诊断按照2014年支气管哮喘全球倡议（GINA）提出“ACOS文件”诊断要求［7］，以及2016年中国支气管哮喘防治指南关于ACOS诊断要点［6］，选择患者既往有哮喘病史，有吸烟等危险因素，肺功能符合慢阻肺诊断标准，且支气管舒张试验FEV1改善率＞12%、绝对值升高＞200 mL即诊断ACOS；慢阻肺、ACOS稳定期及哮喘缓解期标准为患者临床症状、体征、肺功能恢复到急性发作前水平，并维持4周以上；所有病例均未口服激素治疗。排除标准：支气管扩张、间质性肺疾病、肺癌、心脏疾病、结缔组织病等疾病。本研究经九江市第一人民医院科研伦理委员会审核批准，所有病例签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 肺功能测定 采用德国Jeager公司肺功能仪测定第1秒用力呼气容积（FEV1）、用力肺活量（FVC）、FEV1%预计值、FEV1%FVC。重复3次，两次间最佳误差＜5%，取最大值。

1.2.2 研究病例及健康对照者收集呼出气冷凝液（EBC）及血清 EBC收集由专人使用Rtube装置收集，受检者于收集前静坐休息15 min，用蒸馏水漱口3次，收集时取坐位，带鼻夹，含住口器，保持口唇密闭，经口平静呼吸15 min，收集量约为1～4 mL，每管约300 μL分装于EP管中；采集空腹外周静脉血5 mL，无需抗凝处理，2 000 r/min离心15 min，分离血清；所有标本冻存于-80℃冰箱。

1.2.3 炎症因子的测定 EBC、血清中的8⁃isoPG浓度采用酶联免疫测定法（EIA）；MPO、LTB4、IL⁃6浓度采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定（检测参考厂商试剂盒的使用说明书严格操作）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差，组间的比较采用单因素方差分析，组间两两多重比较采用SNK法；分析吸烟指数、年龄、体质指数、肺功能等因素与血清、EBC中炎症因子浓度相关性，采用秩相关分析（spearmen相关系数）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清8⁃isoPG、MPO、LTB4、IL⁃6浓度检测ACOS组、哮喘组、慢阻肺组血清中8⁃isoPG、IL⁃6浓度均显著高于健康对照组；ACOS组、哮喘组及慢阻肺组血清8⁃isoPG浓度差异有显著性，差异均有统计学意义（P＜0.05）；ACOS组、哮喘组、慢阻肺组及对照组血清MPO、LTB4浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 哮喘、慢阻肺、ACOS及对照组血清8⁃isoPG、MPO、LTB4、IL⁃6浓度比较Tab.1 Comparison of serum levels of 8⁃isoPG，MPO，LTB4 and IL⁃6 in asthma，COPD，ACOS and control group ±s

表1 哮喘、慢阻肺、ACOS及对照组血清8⁃isoPG、MPO、LTB4、IL⁃6浓度比较Tab.1 Comparison of serum levels of 8⁃isoPG，MPO，LTB4 and IL⁃6 in asthma，COPD，ACOS and control group ±s

注：采用方差分析及SNK法分析与对照组比较，*P＜0.05

组别对照组哮喘组慢阻肺组ACOS组F值P值例数20 22 24 18 8⁃isoPG（ng/L）14.08±1.89 43.32±12.63*26.54±10.83*66.43±13.43*5.543 0.000 MPO（U）4.03±2.21 4.23±1.89 4.02±2.12 4.14±1.67 1.431 0.623 LTB4（ng/L）89.4±18.75 92.3±20.63 87.5±19.05 90.7±19.65 1.032 0.132 IL⁃6（ng/L）7.43±4.28 16.56±5.89*16.04±5.34*16.45±6.78*3.435 0.021

2.2 EBC中8⁃isoPG、MPO、LTB4、IL⁃6浓度检测 ACOS组、哮喘组、慢阻肺组EBC中8⁃isoPG、MPO、IL⁃6浓度均显著高于对照组；ACOS组EBC中8⁃isoPG水平显著高于哮喘组、慢阻肺组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；ACOS组、哮喘组、慢阻肺组、对照组EBC中LTB4浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 哮喘、慢阻肺、ACOS、健康吸烟者及对照组EBC中8⁃isoPG、MPO、LTB4、IL⁃6的浓度比较Tab.2 Comparison of the EBC concentrations of 8⁃isoPG，MPO，LTB4 and IL⁃6 in asthma，COPD，ACOS，control group ±s

表2 哮喘、慢阻肺、ACOS、健康吸烟者及对照组EBC中8⁃isoPG、MPO、LTB4、IL⁃6的浓度比较Tab.2 Comparison of the EBC concentrations of 8⁃isoPG，MPO，LTB4 and IL⁃6 in asthma，COPD，ACOS，control group ±s

注：采用方差分析及SNK法分析与对照组比较，*P＜0.05；与哮喘组比较，#P＜0.05；与慢阻肺组比较，△P＜0.05

组别对照组哮喘组慢阻肺组ACOS组F值P值例数20 22 24 18 8⁃isoPG（ng/L）6.98±4.23 13.98±7.56*9.23±3.45*20.45±10.22*#△3.235 0.023 MPO（u）4.58±2.45 8.85±5.34*8.53±3.98*9.05±4.32*2.974 0.039 LTB4（ng/L）16.85±7.93 15.57±8.56 17.45±9.43 16.57±10.34 1.085 0.145 IL⁃6（ng/L）2.98±0.28 5.03±1.43*5.32±1.32*5.54±1.34*2.843 0.041

2.3 EBC中8⁃isoPG浓度与临床指标相关性分析 ACOS组EBC中8⁃isoPG水平与年龄、吸烟指数、体质指数、FEV1%预计值无明显相关性（P＞0.05）。见表3。

表3 EBC中8⁃isoPG浓度与临床指标相关性Tab.3 Correlation of the EBC 8⁃isoPG concentration and clinical index

3 讨论

2014年慢阻肺全球防治策（GOLD）和支气管哮喘全球倡议（GINA）联合提出“ACOS文件”，该文件提供了区分哮喘、慢阻肺及ACOS的方法，但同时也指出ACOS的定义不完善［7-8］。最近研究表明LTB4和8⁃isoPG是参与慢阻肺、哮喘生理病理过程的炎症介质［9］，可作为反映气道炎症和氧化应激的标志物；研究显示MPO能评价慢阻肺患者全身或局部炎症水平和氧化应激程度［10］；大量研究［4］证实细胞因子白三烯家族（IL）是反映慢阻肺、哮喘等气道、系统炎症的良好指标；但这些炎症标志物在ACOS中的作用、功能、能否作为鉴别诊断标志物并不明确。EBC检测近年来备受关注，通过对呼呼气冷凝收集并检测其中成分，对气道情况进行直观的监测。

本研究发现ACOS、哮喘、慢阻肺患者处于稳定期（缓解期）时血清、EBC中8⁃isoPG水平高于健康对照组，ACOS组EBC中8⁃isoPG水平显著高于哮喘、慢阻肺组患者；8⁃isoPG是一类新的前列腺素，与气道炎症细胞的浸润程度相平行，是敏感的氧化应激反应的标记物［11］，本研究结果说明ACOS患者全身及气道内均存在氧化应激反应，ACOS患者气道内氧化应激反应较哮喘及慢阻肺患者更为严重的。我们推测其原因可能为：（1）大量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞在ACOS患者支气管黏膜和肺泡聚积，环氧合酶2（COX⁃2）表达增强，引起其产物前列腺素类物质（包含8⁃isoPG）合成增加［11-12］；（2）激活的炎症细胞和气道上皮细胞释放大量的氧自由基（ROS）；启动呼吸爆发导致ACOS患者氧化/抗氧化失衡［12］。（3）大量的8⁃isoPG放大肺部的炎症反应，使ACOS病情进一步恶化。本研究发现EBC中8⁃isoPG水平与年龄、吸烟指数、体重、FEV1%预计值无明显相关性；因此笔者认为8⁃isoPG可能是ACOS一种性质稳定的炎症标志物，检测EBC中8⁃isoPG水平可能具有潜在的将ACOS与哮喘、慢阻肺相鉴别的作用；由于样本量的局限，需要大量样本的进一步研究以证实。

本研究结果显示ACOS组、哮喘组、慢阻肺组EBC中MPO较健康对照组升高；ACOS组、哮喘组、慢阻肺组间EBC中MPO水平无明显差异。MPO是反映中性粒细胞活性状态重要指标，可致使氧化性肺组织损伤［13］。本研究结果说明MPO作为炎症递质参与ACOS患者气道内的炎症过程，而ACOS、哮喘、慢阻肺患者稳定期间气道内炎症活性状态（中性粒细胞）可能无明显差异。本研究显示ACOS组、慢阻肺组、哮喘组及健康对照组血清、EBC中LTB4水平无显著差异；LTB4是一种致炎作用强烈的炎性介质，从巨噬细胞和嗜酸性粒细胞和活化中性粒细胞释放出来，参与哮喘、慢阻肺等气道炎症性疾病过程［14-15］。笔者认为LTB4参与了ACOS气道炎症，通过治疗达到稳定期后，气道内炎症细胞水平下降接近甚至达到正常水平，因而气道内及血清LTB4可恢复至正常水平。本研究显示ACOS组、慢阻肺组、哮喘组血清、EBC中IL⁃6水平均高于健康对照组，而ACOS、慢阻肺、哮喘组间血清、EBC中的IL⁃6水平无明显差异；IL⁃6是一种具有多种生物学功能的细胞因子，能够介导肺脏组织局部炎症反应的级联放大，促进支气管平滑肌炎症损伤［16］。本研究结果说明IL⁃6持续参与ACOS气道的慢性炎症，而IL⁃6反映的ACOS、哮喘、慢阻肺患者稳定期间气道的慢性炎症程度可能无明显差异。

综上所述，本研究认为8⁃isoPG、LTB4、MPO、IL⁃6等炎症因子参与了ACOS患者肺组织慢性炎症和（或）氧化应激过程；8⁃isoPG可能是ACOS一种性质稳定的炎症标志物，EBC中8⁃isoPG可能具有潜在的鉴别ACOS生物标志物价值，由于本研究样本量的局限需要进一步研究以证实。

参考文献

［1］SATES A，TAUBE C.Asthma and chronic obstructive pulmo⁃nary disease overlap：asthmatic chronic obstructive pulmonary disease or chronic obstructive asthma？［J］.Ther Adv Respir Dis，2016，10（1）：57⁃71.

［2］KILJANDER T，HELIN T，VENHO K，et al.Prevalence of asthma⁃COPD overlap syndrome among primary care asthmatics with a smoking history：a cross⁃sectional study［J］.Prim Care Respir Med，2015，25：15047.

［3］CHRISTENSON S A，STEILING K，Van DEN BERGE M，et al.Asthma⁃COPD overlap.Clinical relevance of genomic signa⁃tures of type 2 inflammation in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Am J Respir Crit Care Med，2015，191：758⁃766.

［4］KONSTANTINIDI E M，LAPPAS A S，TZORTZI A S.Exhaled breath condensate：technical and diagnostic aspects［J］.Scien⁃tific World J，2015，2015：435160.

［5］中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013年修订版）［J］.中华结核和呼吸杂志，2013，36（04）：255⁃264.

［6］中华医学会呼吸病学分会哮喘组.支气管哮喘防治指南（2016年版）［J］.中华结核和呼吸杂志，2016，39（09）：675⁃697.

［7］Global Initiative for Asthma.The global strategy for asthma man⁃agement and prevention（Revised 2014）［EB/OL］.［2014⁃05⁃08］.http：//www.Ginasthma.org.

［8］GOLD Executive Committee.Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary⁃disease（Revised 2014）［EB/OL］.［2014⁃05⁃08］.http：//www.goldcopd.com.

［9］BRADLEY P，PLIEBAT D A，CHFISTENSEN R D，et a1.Measuremnt of cutsneous inflammation：estimation of neutrophil content with an enzyme marker［J］.Invest Dermatol，1982，78：206⁃209.

［10］PORTO B N，STEIN R T.Neutrophil extracellular traps in pulmonary diseases：too much of a good thing？［J］.Front Im⁃munol，2016，7：311.

［11］DROZDOVVSZKY O，BARTA I，ANTUS B.Sputum eicosanoid profiling in exacerbations of chronic obstructive pulmonary dis⁃ease［J］.Respiration，2014，87（5）：408⁃415.

［12］ANTUS B.Oxidative Stress Markers in Sputum［J］.Oxid Med Cell Longev，2016，2016：2930434.

［13］SALONEN I，HUTTUNEN K，HIRVONEN M R，et al.Serum myeloperoxidase is independent of the risk factors of atheroscle⁃rosis［J］.Coron Artery Dis，2012，23（4）：251⁃258.

［14］LIU M，YOKOMIZO T.The role of leukotrienes in allergic dis⁃eases［J］.Allergol Int，2015，64（1）：17⁃26.

［15］高蔚，王丽，芳沈威.慢性阻塞性肺疾病患者呼出气冷凝液中8⁃异前列腺素、白三烯B4检测的临床意义［J］.实用医学杂志，2010，26（14）：2527⁃2529.

［16］RUBINI A.Interleukin⁃6 and lung inflammation：evidence for a causative role in inducing respiratory system resistance［J］.In⁃flamm Allergy Drug Targets，2013，12（5）：315⁃321.