选择性β3肾上腺素能受体激动剂对非酒精性脂肪性肝病大鼠血清氧化应激指标和肝组织纤维化的影响

王新伟，吕柯，孙晓，张菊

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是临床较为常见的慢性肝病，以肝细胞弥漫性大泡性脂肪变性和脂肪储积为主要特征的临床综合征，可进展为脂肪性肝纤维化、肝硬化以及终末期肝衰竭[1]。目前，NAFLD发病机制尚不明确。近年来，有研究发现，β3肾上腺素能受体（β3-adrenergic receptor，β3-AR）能与其特异性配体结合，参与机体脂质代谢和体质量控制等多种生理效应。β3-AR功能障碍可能导致多种生理效应的异常，如脂质代谢异常、肥胖、胰岛素抵抗等[2-4]，可能参与了NAFLD的发病过程。本研究采用高脂饮食建立大鼠NAFLD模型，观察了β3-AR激动剂干预对动物血脂、肝功能、氧化应激和肝纤维化指标的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂与仪器 无特定病原体（sprcific pathogen free，SPF）级健康雄性SD大鼠30只，体质量（200±20）g，饲养温度（22±3）℃，湿度为60%～80%。高脂饲料（42%脂肪+17%蛋白质+41%碳水化合物）购自上海斯莱克实验动物研究有限公司；普通饲料（14%脂肪+24%蛋白质+62%碳水化合物）由重庆医科大学实验动物中心提供；β3-AR激动剂（BRL 37344）购自美国Sigma公司；检测大鼠透明质酸（hyaluronic acid，HA）的ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，检测转化生长因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的ELISA试剂盒购自美国R＆D公司；检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase-Px，GSH-Px）试剂盒购自南京建成生物科技研究所；AU5800全自动生化分析仪为美国贝克曼公司产品。

1.2 动物NAFLD模型的建立 将30只大鼠随机分为对照组（NC）组、高脂模型组（HC组）和β3-AR激动剂干预组（BRL组），每组10只。在NC组，给予普通饲料喂养14 w，第8 w末时，给予0.9%氯化钠溶液4 nmol·kg-1尾静脉注射；在HC组，给予高脂饲料喂养14 w，第8 w末时给予0.9%氯化钠溶液4 nmol·kg-1尾静脉注射；在BRL组，给予高脂饲料喂养14 w，第8 w末时给予BRL-37344 4 nmol·kg-1尾静脉注射。3组均2次/w注射，持续用药6 w。在14 w末，大鼠隔夜禁食12 h，3%戊巴比妥钠麻醉，采用断头法处死所有动物，迅速按常规采血8～10 mL，3000 r/m离心10 min，分离上层血清，并转移入新的EP管中，-80℃低温下保存。采血后，迅速摘除肝脏称质量，-80℃低温下保存。将低温保存的肝组织于4℃冰箱解冻，测定。

1.3 检测方法 取血清，室温解冻，使用全自动生化分析仪检测血清甘油三酯（triglycerid，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）；采用 ELISA 法检测血清HA和TGF-β1）。精确称取肝组织200 mg，匀浆，冰浴条件下2000 r/m离心3～5 min，制备10%肝组织匀浆。使用分光光度计测定肝组织匀浆SOD、MAD 和 GSH-Px。

1.4 肝组织病理学检查 将固定后的肝组织进行石蜡包埋、切片，分别行苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色，在光镜下观察非酒精性脂肪性肝病活动积分（NAFLD activity，NAS）和肝纤维化分期。NAS评分包括肝细胞脂肪变性（＜5%为0分，5%～33%为1分，34%～66%为2分，＞66%为3分）、炎性浸润（20倍光镜下计算坏死病灶，无为0分，＜2个为1分，2～4个为2分，＞4个为3分）和气球样变（无为0分，少见为1分，多见为2分）；肝纤维化分期标准：无为0分，少量门脉区纤维化，有或无细胞间隔纤维化为1分，大量门脉区纤维化，有或无细胞间隔纤维化为2分，大量门脉区纤维化伴随少量的不典型桥接纤维化为3分，大量的门脉区纤维化伴有显著的桥接纤维化为4分，显著的桥接纤维化，有或无不典型的假小叶为5分，高度可疑或诊断为肝硬化为6分。

1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，分析前先检验数据是否服从正态分布。对符合正态分布的数据以±s表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LDS-t检验；对非正态分布的数据采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠血清生物化学指标比较 HC组和BRL 组血清 TC、TG、ALT、AST、HA 和 TGF-β1 显著高于对照组（P＜0.05），而BRL组上述指标显著高于 HC 组（P＜0.05，表1）。

表1 各组大鼠血生物化学指标（±s）比较

表1 各组大鼠血生物化学指标（±s）比较

与NC组比，①P＜0.05；与HC组比，②P＜0.05

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2.2 三组大鼠肝组织SOD、MDA和GSH-Px水平比较 HC组和BRL组肝组织SOD和GSH-Px水平显著低于，而MDA水平显著高于HC组（P＜0.05）；BRL组肝组织SOD和GSH-Px水平显著低于，而MDA水平显著高于HC组，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 三组大鼠肝组织SOD、MDA和GSH-Px 水平（±s）比较

表2 三组大鼠肝组织SOD、MDA和GSH-Px 水平（±s）比较

与NC组比，①P＜0.05；与HC组比，②P＜0.05

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2.3 三组大鼠肝组织病理学变化情况的比较 HC组和BRL组肝组织脂肪变性、炎性浸润、气球样变和纤维化评分均显著高于NC组（P＜0.05），而BRL组上述指标显著高于HC组，差异有统计学意义（P＜0.05，表3、图 1、图 2）。

表3 三组大鼠肝组织病理学评分（±s）比较

表3 三组大鼠肝组织病理学评分（±s）比较

与NC组比，①P＜0.05；与HC组比，②P＜0.05

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图1 肝组织病理学表现（HE，100×）

图2 肝组织病理学表现（Masson，100×）

3 讨论

肝纤维化是慢性肝病发展的共同途径，以细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白沉积为特征，伴随肝脏功能和结构的异常，继续发展可诱发肝硬化或肝癌[5，6]。

目前，NAFLD发病机制尚不明确，以“二次打击”学说占主导地位，即胰岛素抵抗、氧化应激反应和异常的细胞因子参与的炎症反应为核心的二次打击导致肝脏发生炎症坏死、肝纤维化[9，10]。在NAFLD发生后，肝细胞内过剩的游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）发生脂质过氧化反应，诱导活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）大量产生，导致脂质过氧化损伤。既往研究报道，肝细胞损伤时ROS含量明显升高[11]。ROS含量增多可导致机体内多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，并形成脂质过氧化物（lipid peroxide，LPO），LPO可通过炎性细胞浸润激活肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSCs），引发肝纤维化，启动TGF-β1、转录因子转录，加重机体炎性反应，增加纤维细胞生成。有研究报道，TGF-β1可促使HSCs活化，是肝纤维化的始动因子[12，13]。SOD和GSH-Px可清除机体内多余的氧自由基，而MDA是脂质过氧化产物的典型代表，其水平可代表机体细胞受氧自由基攻击的程度[14]。

β3-AR为一种G蛋白偶联的膜表面受体，具有调节脂肪分解和消耗的作用。近年来，有研究表明，β3-AR与胰岛素抵抗和肥胖密切相关[15，16]，还有研究指出，β3-AR异常可能导致脂质过氧化反应[17-19]。国内研究报道，儿茶酚胺可通过β3-AR与鸟嘌呤核苷酸和腺苷酸环化酶等作用，刺激细胞脂肪氧化分解，抑制肝脏脂肪合成，控制NAFLD进展[19，20]。因此，考虑β3-AR可能参与了NAFLD发生过程。鉴于此，我们观察了β3-AR受体激动剂对NAFLD大鼠肝脏氧化应激及血清肝纤维化指标的影响，结果发现，HC组在BRL-373干预后，氧化应激反应及肝纤维化程度加剧，提示AR-β3激动剂可能加重NAFLD肝纤维化形成。

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