敲减CCAAT/增强子结合蛋白α通过增加O-GlcNAc糖基化水平促进肝癌细胞体外增殖*

李文姣，曹海超，马澜婧，张 松，丁美玲，张浩浩，聂勇战

CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/en-hancerbinding protein alpha，C/EBPα）是一种亮氨酸拉链蛋白，与能量代谢和细胞分化密切相关[1-5]。研究表明肝脏条件性C/EBPα敲除小鼠存在葡萄糖耐量异常，血清胆固醇减少及肝脏脂肪变，说明C/EBPα在肝脏的糖脂代谢稳态发面发挥着重要的作用[6，7]。很多实体瘤C/EBPα表达下降，包括肝脏、乳腺、肺、前列腺、胰腺、胆囊和胃等[8-10]。临床研究发现肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者癌和癌旁组织C/EBPα表达下降，并且与肿瘤的进展和患者生存期降低密切相关[11，12]。O-GlcNAc糖基化修饰是一种重要的营养敏感糖修饰，由两种关键的酶乙酰葡糖胺转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和乙酰葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase，OGA）利用己糖胺代谢途径的终产物鸟苷二磷酸氮乙酰葡糖胺（uridine diphosphate N-acetylglucosamine，UDP-G lc-NAc）来维持O-GlcNAc糖基化修饰的稳态[13，14]。升高的O-GlcNAc糖基化修饰与多种代谢异常相关，如胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病以及肿瘤相关的代谢重编程[15]。在HCC患者癌组织中O-GlcNAc糖基化修饰表达上调，并与肿瘤的发生进展以及肝移植后的肿瘤复发密切相关[16，17]。本研究发现敲减C/EBPα后在不同葡萄糖浓度下都会促进肝癌细胞的体外增殖，并能下调OGA的表达，从而升高细胞整体的O-GlcNAc糖基化修饰水平。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器 人肝癌细胞Hep3B由国家肿瘤生物重点实验室提供；胎牛血清（FBS）、Opti-MEM和0.25%胰酶Trypsin购自Gibco公司；高糖DMEM和低糖DMEM购自美国Hyclone公司；青霉素 /链霉素（PS）、二甲基亚矾（DMSO）购自美国Sigma公司；CCK-8试剂盒购自ZETA LIFE公司，逆转录试剂盒购自TAKALA公司；化学发光仪、全自动酶标仪（BIO-RAD550）和Real-time PCR仪购自美国Bio-rad公司。

1.2 细胞培养与低糖处理 配制含10%FBS的89%DMEM培养基和1%PS的培养液。当细胞生长至80%～90%时，用0.25%胰酶消化、传代。接种6孔板，细胞在正常高糖培养基中贴壁生长24 h，用PBS清洗2遍，更换正常高糖（NG，4.5 g/L）或者低糖培养基（LG，1 g/L）。

1.3 慢病毒感染 取对数生长期的Hep3B细胞，将其铺入24孔板，置于培养箱中，待细胞密度达到50%～60%。将原培养基更换为Opti-MEM，并加入Polybrene至终浓度 5 μg/ml，然后加入靶向C/EBPα的RNAi慢病毒，对照组加入阴性对照病毒。常规培养16 h后，换为原培养液。细胞在感染病毒48～72 h后，在荧光显微镜下观察细胞所带GFP绿色荧光。培养至细胞长满约90%，转入6孔板，加入终浓度2 μg/ml嘌呤霉素，筛选1～2 w，每2天换液，待培养液不再有漂浮的死细胞后筛选完毕。

1.4 细胞增殖检测 使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性。

1.5 细胞目标分子mRNA水平检测 采用qRT-PCR法，用TAKALA总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，定量。在20μl反应体系中，含有总RNA 1000 ng，在 37℃，30 min，85℃，5 s的条件下进行反转录，获得cDNA。采用SYBR green实时定量PCR法检测目标分子水平。实验重复3次，用2△△Ct进行数据分析。

1.6 细胞目标分子蛋白表达水平检测 采用Western blot法，待细胞在正常高糖培基中贴壁后更换低糖培养基，分别培养24 h和48 h，提取总蛋白。经10%SDS-PAGE凝胶电泳后转入PVDF膜上，用含有5%TBST的脱脂牛奶室温孵育1 h，加入抗 C/EBPα（CST，1:1000稀释）、抗 OGA（abcam，1：1000 稀释）、抗 O-GlcNAc（novus，1：1000 稀释），4℃摇床孵育过夜。次日，加TBST洗膜3次，每次5～10 min，加入HRP标记的二抗，室温摇床孵育1 h，洗膜3次，在化学发光液中显影，结果用Lmage-lab图像软件分析。

1.7 统计学分析 计量资料以±s表示，采用t检验。应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，P＜0.05被认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 成功构建C/EBPα敲减Hep3B细胞系 利用RNAi慢病毒感染Hep3B细胞，构建C/EBPα敲减细胞模型。由于重组质粒的靶序列下游带有绿色荧光蛋白基因，慢病毒感染48 h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，说明插入的靶序列可以有效转录（图1A）。经嘌呤霉素筛选后，行C/EBPα敲减稳转细胞系鉴定。qRT-PCR检测结果显示，与对照细胞比，RNAi慢病毒感染细胞C/EBPα mRNA水平下调（7.5±2.3）倍（P＜0.05，图 1B）；Western blot检测结果显示，RNAi慢病毒感染细胞C/EBPα蛋白表达水平明显下调（图1C），灰度值分析显示C/EBPα敲减后蛋白表达水平下调了（8.8±0.25）倍（P＜0.001，图 1D），上述结果证明 C/EBPα 敲减的稳转细胞系构建成功。

图1 成功构建C/EBPα敲减Hep3B细胞系

2.2 敲减C/EBPα可促进Hep3B细胞增殖 在我们的细胞培养过程中，发现敲减C/EBPα后细胞的生长速度明显快于对照组细胞。利用CCK-8实验测定细胞增殖活性，发现敲减C/EBPα可以促进细胞增殖（图2A）。在低葡萄糖（LG，1 g/L）条件下刺激48 h和72 h后，敲减C/EBPα分别促进细胞增殖 15.4%（P＜0.05）和 25.0%（P＜0.01，图 2B）。

图2 敲减Hep3B细胞增殖加速

2.3 敲减C/EBPα增加O-GlcNAc糖基化修饰 在低葡萄糖刺激24 h和48 h后，敲减C/EBPα可以下调细胞OGA蛋白表达水平（图3A）。灰度分析显示，与对照组比，敲减C/EBPα细胞在正常高糖及低糖刺激24 h和48 h时，OGA蛋白表达分别下调了70.1%（P＜0.01）、51.4%（P＜0.05）和 61.2%（P＜0.05，图3B）。而整体O-GlcNAc糖基化水平高于对照组。灰度分析显示，在低糖作用48 h时，灰度值升高80.6%（P＜0.05，图 3C），说明下调 C/EBPα 可以影响细胞整体O-GlcNAc糖基化修饰状态，而OGA表达下调可以在一定程度上解释O-GlcNAc糖基化修饰的改变。在正常高糖条件下，敲减C/EBPα后细胞OGA mRNA水平有下调趋势，但无明显的统计学差异。当给予低葡萄糖刺激后OGA mRNA水平升高，在48 h时其水平增加了77.4%（P＜0.05，图3D）。

图3 敲减C/EBPα增加O-GlcNAc糖基化修饰

3 讨论

在本研究中，我们发现敲减C/EBPα后明显促进了Hep3B肝癌细胞的增殖速率，并且在低葡萄糖的营养状态下这种促进作用更为明显。既往研究发现HCC患者癌组织比癌旁组织C/EBPα表达下降，而这种变化与肿瘤转移和临床不良预后密切相关，有望成为评价HCC预后的新指标[18，19]。在小鼠肝癌模型，肝脏特异性的C/EBPα敲入可明显减小瘤体的形成，降低肿瘤的增殖能力[20]。目前，已设计出C/EBPα短激活 RNA（small-activating RNA，saRNA）来增加C/EBPα转录水平。在HepG2细胞，转染C/EBPα的saRNA后细胞白蛋白的分泌可以增加3倍左右，肿瘤细胞的增殖速率降低50%左右。在动物模型中，当给肝硬化伴多病灶肝癌的大鼠尾静脉注射C/EBPα的saRNA后，大鼠血清白蛋白增加了超过30%，并且谷草转氨酶和谷丙转氨酶都有一定程度的升高。另外，注射C/EBPα saRNA后大鼠的肿瘤负荷降低约80%，并抑制甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）的表达[21]。在肝脏原位移植瘤注射C/EBPα的saRNA后可以抑制原位移植瘤的形成以及肝内和远处肺脏转移瘤的形成。这些研究为C/EBPα治疗HCC提供了新的思路和方法。

本研究发现在C/EBPα敲减后细胞OGA表达下调，整体的O-GlcNAc糖基水平升高。既往研究发现在HCC患者的癌组织O-GlcNAc水平明显高于癌旁组织，而且在肝移植后复发性HCC组织中O-GlcNAc高于未复发组。OGA是O-GlcNAc糖基化修饰的特异水解酶，OGA的表达降低可以作为肝癌肝移植后是否复发的独立危险因子。本实验中，在低糖刺激的条件下OGA mRNA水平明显升高，说明还存在其他的调节机制调节OGA的表达，这些有待进一步的研究证实。

总的来说，本实验证实敲减C/EBPα在正常高糖和低糖条件下均可以明显促进HCC细胞的增殖，敲减C/EBPα后，重要的营养感知因子O-GlcNAc糖基化水平整体升高，OGA表达有所下调，可能是敲减C/EBPα促HCC发生新的作用机制。随着对于C/EBPα靶向saRNA的研究进展，基于C/EBPα在肝脏能量代谢和肝癌抑制方面的双重作用，C/EBPα有望成为靶向治疗HCC的新靶点。

【参考文献】

[1]Zhu Z X，Huang J W，Liao M H，et al.Treatment strategy for hepatocellular carcinoma in China:radiofrequency ablation versus liver resection.Jpn J Clin Oncol，2016，46（12）:1075-1080.

[2]Chen W，Zheng R，Baade P D，et al.Cancer statistics in China，2015.CA Cancer J Clin，2016，66（2）:115-132.

[3]余红星，陈颖，刘自鹏，等.超声引导下经皮射频消融与激光消融治疗微小肝癌患者疗效初步比较研究.实用肝脏病杂志，2017，20（3）:320-323.

[4]王鹤，董家鸿，卢实春，等.手术切除与射频消融治疗原发性肝癌患者预后比较.实用肝脏病杂志，2017，20（3）:337-340.

[5]Roxburgh P，Evans T R.Systemic therapy of hepatocellular carcinoma:are we making progress.Adv Ther，2008，25（11）:1089-1104.

[6]Yang J，Croniger CM，Lekstrom-Himes J，et al.Metabolic response of mice to a postnatal ablation of CCAAT/enhancer-binding protein alpha.J Biol Chem，2005，280（46）:38689-38699.

[7]Wang N D，Finegold M J，Bradley A，et al.Impaired energy homeostasis in C/EBP alpha knockout mice.Science，1995，269（5227）:1108-1112.

[8]Gery S，Tanosaki S，Bose S，et al.Down-regulation and growth inhibitory role of C/EBPalpha in breast cancer.Clin Cancer Res，2005，11（9）:3184-3190.

[9]Koschmieder S，Halmos B，Levantini E，et al.Dysregulation of the C/EBPalpha differentiation pathway in human cancer.J Clin Oncol，2009，27（4）:619-628.

[10]Pan Z，Zheng W，Zhang J，et al.Down-regulation of the expression of CCAAT/enhancer binding protein alpha gene in cervical squamous cell carcinoma.BMC Cancer，2014，14:417.

[11]Zhang S，Jiang T，Feng L，et al.Yin Yang-1 suppresses differentiation of hepatocellular carcinoma cells through the downregulation of CCAAT/enhancer-binding protein alpha.J Mol Med（Berl），2012，90（9）:1069-1077.

[12]Tseng H H，Hwang Y H，Yeh K T，et al.Reduced expression of C/EBP alpha protein in hepatocellular carcinoma is associated with advanced tumor stage and shortened patient survival.J Cancer Res Clin Oncol，2009，135（2）:241-247.

[13]Hardiville S，Hart G W.Nutrient regulation of signaling，transcription，and cell physiology by O-GlcNAcylation.Cell Metab，2014，20（2）:208-213.

[14]Love D C，Ghosh S，Mondoux M A，et al.Dynamic O-GlcNAc cycling at promoters of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity，stress，and immunity.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（16）:7413-7418.

[15]Ma Z，Vosseller K.Cancer metabolism and elevated O-GlcNAc in oncogenic signaling.J Biol Chem，2014，289（50）:34457-34465.

[16]Xu W，Zhang X，Wu J L，et al.O-GlcNAc transferase promotes fatty liver-associated liver cancer through inducing palmitic acid and activating endoplasmic reticulum stress.J Hepatol，2017，67（2）:310-320.

[17]Zhu Q，Zhou L，Yang Z，et al.O-GlcNAcylation plays a role in tumorrecurrence ofhepatocellularcarcinoma following liver transplantation.Med Oncol，2012，29（2）:985-993.

[18]Lourenco A R，Coffer P J.A tumor suppressor role for C/EBPalpha in solid tumors:more than fat and blood.Oncogene，2017，36（37）:5221-5230.

[19]Tseng H H，Hwang Y H，Yeh K T，et al.Reduced expression of C/EBP alpha protein in hepatocellular carcinoma is associated with advanced tumor stage and shortened patient survival.J Cancer Res Clin Oncol，2009，135（2）:241-247.

[20]Tan E H，Hooi S C，Laban M，et al.CCAAT/enhancer binding protein alpha knock-in mice exhibit early liver glycogen storage and reduced susceptibility to hepatocellular carcinoma.Cancer Res，2005，65（22）:10330-10337.

[21]Zhao X，Voutila J，Ghobrial S，et al.Treatment of Liver Cancerby C/EBPA saRNA.Adv Exp Med Biol，2017，983:189-194.