肝细胞癌患者血清和肝组织microRNAlet-7水平及其与临床预后的关系*

张金莲，蔡兆根，吴琼，秦燕子，王梦慧，董修芹

microRNA分子是一类非编码微小RNA，被临床试验证实与肿瘤的发生发展有关[1-3]。let-7家族属于microRNA中的一员。研究报道指出，let-7在肺癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞中呈低水平状态，有抑制肿瘤生长和肿瘤细胞转移的作用[4，5]。为进一步研究let-7家族与肝细胞癌（HCC）发生发展的关系，本文检测了54例HCC患者血清和肿瘤组织let-7a和let-7b水平，并分析了其与患者预后的关系，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年4月～2016年6月在我院接受治疗的HCC患者54例，男性42例，女性12例；年龄为35～64岁，平均年龄（49.8±10.6）岁。符合《原发性肝癌诊疗规范》的诊断标准，同时排除存在精神类疾病或已进行放化疗者，其中TNM I期28例，Ⅱ期6例，Ⅲ～IV期20例；肿瘤直径＜5 cm者23例，≥5 cm者31例；无血管浸润者33例，有血管浸润者21例。另选择同期来我院进行体检的52例健康人作为对照组，男性38例，女性14例；年龄33～62岁，平均年龄（50.1±10.9）岁。两组年龄和性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究获得医院医学伦理委员会批准，患者及其家属签署知情同意书。

1.2 血清和肝组织microRNA let-7a和let-7b水平检测 采集外周血4 ml，静置于室温下，待血清凝固后4000 r/min离心10 min，将上层血清置入无RNA酶管。取54例HCC患者手术切除的HCC组织及其癌旁组织，-80℃贮存备用。提取RNA试剂盒购自北京中杉金桥公司，荧光定量PCR试剂盒购自美国英杰公司。let-7及内参U6购自美国Proteintech公司，荧光定量PCR仪购自Thermo-Forma公司。根据miRNA逆转录试剂盒说明书操作。建立20 μl反应体系。反应液配比见表1（冰上完成）。将上述反应体系混合均匀，短暂离心后放置冰块上。RT-PCR 反应条件：温度为16℃或42℃，30 min；85℃，5 min；4℃保存。按照 qRT-PCR 试剂盒说明书操作。建立20 μl反应体系，反应液的配置情况见表2。使用Roche Light Cyeler480实时荧光定量 PCR系统进行检测。反应参数：第一步：95℃，10 min；第二步：95℃，15 s；60℃，45 s，共40个循环。以U6为参照，计算let-7a和let-7b相对水平，计算公式为 RQ=2-△△Ct，重复测量 3 次，取平均值[6]。

表1 逆转录反应液配比

表2PCR反应液配比

1.3 诊断方法和病理学检查 术前行B超和增强CT等影像学检查，经术后组织病理学检查诊断[7]。

1.4 统计学处理 应用SPSS 22.00统计学软件，计量资料以±s表示，采用独立t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清let-7a和let-7b水平比较 HCC患者血清let-7A和let-7b水平显著低于健康人（P＜0.05，表3）。

2.2 HCC患者癌组织与癌旁组织let-7a和let-7b水平比较 癌组织let-7a和let-7a水平均显著低于癌旁组织（P＜0.05，表4）。

表3 两组血清let-7a和let-7b水平（±s）比较

表3 两组血清let-7a和let-7b水平（±s）比较

例数let-7a（2-△△Ct）let-7b（2-△△Ct）HCC 54 0.6±0.4 0.3±0.1健康人 52 1.1±0.4 0.7±0.2 t 6.434 13.097 P＜0.001 ＜0.001

表4 癌组织与癌旁组织let-7a和let-7b水平（±s）比较

表4 癌组织与癌旁组织let-7a和let-7b水平（±s）比较

差异表达倍数（fold change）表示癌组织/癌旁组织let-7a和let-7b水平差异的倍数，其值≥2表示有差异，负值提示低水平

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2.3 不同临床和病理学指标HCC患者血清let-7a和let-7b水平比较 有癌栓形成的HCC患者血清let-7a和let-7b水平显著低于无癌栓形成患者（P＜0.05），但不同年龄、不同性别、血清AFP水平高低、肿瘤大小、不同细胞分化程度和TNM分期及有无肿瘤血管浸润患者血清let-7a和let-7b水平无显著性差异（P＞0.05，表5）。

表5 不同临床和病理学指标HCC患者血清let-7a和 let-7b 水平（±s）比较

表5 不同临床和病理学指标HCC患者血清let-7a和 let-7b 水平（±s）比较

与无癌栓形成者比，①P＜0.05

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2.4 不同临床和病理学指标HCC患者癌组织let-7a和let-7b水平比较 不同年龄、性别、血清AFP水平、肿瘤大小、细胞分化、TNM分期和有无血管浸润或癌栓形成的HCC患者癌组织let-7a和let-7b水平均无显著性差异（P＞0.05，表6）。

表6 不同临床和病理学指标HCC患者癌组织let-7a和 let-7b水平（±s）比较

表6 不同临床和病理学指标HCC患者癌组织let-7a和 let-7b水平（±s）比较

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3 讨论

改善肝癌患者的预后是目前临床研究的重点，但现在仍缺乏能够准确地预测患者预后的分子标志[8]。miRNA是一种能够参与生物体发育、代谢、细胞凋亡的非编码RNA分子。报道显示miRNA更为稳定，经过各种环境变化仍能保持不变，可望成为可以应用的预测肿瘤患者预后的标志物[9,10]。let-7为发现较早的一种miRNA，其家族中共包含10名成员，其中let-7a是目前研究最多的一种miRNA。在对let-7家族的深入研究中发现，let-7在乳腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤中组织均呈明显低水平，let-7家族能够与原癌基因 RAS、HMGA2和 C-myc的3'UTR结合，负调控靶标基因的表达，进而起到促进细胞调亡的作用[11，12]。国外[13，14]研究显示，let-7 与肿瘤的发生发展高度相关，并能发挥抑癌基因的作用。在肺癌组织中let-7呈低水平状态，且其低水平与肺癌术后患者生存期有关[15]。相关研究还指出，let-7a可以抑制肺癌和直肠癌等肿瘤的生长[16-18]。

本研究结果显示，HCC患者血清 let-7a和let-7b水平明显低于健康人（P＜0.05）；HCC患者肝癌组织let-7a和let-7b水平比癌旁组织呈明显的下调趋势，提示血清和癌组织let-7a和let-7b水平可能为HCC患者重要的血清分子生物学指标，对早期诊断HCC的疾病进展具有参考价值。单因素分析发现肝癌患者血清let-7a和let-7b水平与肿瘤患者门静脉癌栓存在一定的关系。肝癌患者癌组织let-7a和let-7b相对水平与患者血清水平相一致,即癌组织let-7a和let-7b水平也降低。单因素分析结果还显示，血清和组织let-7a和let-7b水平在不同年龄、不同性别、血清AFP水平高低、肿瘤大小、不同细胞分化程度和TNM分期及有无肿瘤血管浸润患者无显著性差异（P＞0.05），其结果还有待验证。癌栓是一种出现于微循环、淋巴管和大小动静脉的栓子。由于在肿瘤生长过程中，淋巴和血管受癌细胞侵犯，出现凝血功能异常和血流动力学障碍，还可导致血栓形成。本研究结果显示，有癌栓形成的患者血清let-7a和let-7b水平降低，可能原因为低水平的let-7a和let-7b对肿瘤细胞的抑制作用减弱，使得恶性肿瘤细胞加速生长、侵袭和扩散，进而影响局部血流动力学，形成癌栓。国内外相关研究报道[19-22]显示，let-7a水平与HCC患者肿瘤大小存在相关性，而本组血清let-7a和let-7b水平在不同肿瘤大小等各项临床指标患者间无显著差异，可能与本研究选择的病例数、取样时间和检测方法的可靠性等因素有关，说明HCC患者血清let-7a水平还容易受到多种因素的干扰。

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