促红细胞生成素对早期外伤性癫大鼠的保护作用及对bcl-2和caspase-10表达的影响

王 文，乔 伟，杜 陈，黄其军，石全红,谢延风，冯爱平

材料与方法

1 研究对象

体重为(250±15)g左右的30只雄性SD大鼠作为本文的研究对象。并按照随机数字表法分成实验组、模型组以及对照组3组，每组各10只。本次实验，采用购于美国Sigma公司的FeCl3溶液；1500IU/0.5mL重组人促红细胞生成素(r-HuEPO)注射液购于沈阳三生制药股份有限公司；美国Proteintech Group公司的caspase-10兔多克隆抗体，Abcam公司的bcl-2兔单克隆抗体；日本TaKaRa公司的逆转录试剂盒、Trizol RNA抽提试剂；北京六合华大基因科技公司合成的PCR引物、北京中杉金桥公司β-肌动蛋白(actin)鼠多克隆抗体。

2 FeCl3外伤性癫模型的制作及观察

3 标本采集

伤后24h，通过腹腔注射水合氯醛的方式，对大鼠进行麻醉，断头取脑，然后对左侧大脑皮层注射区域标本进行分离。从构成上看，各个标本都涉及两部分内容，都需要进行3次冲洗，分别是DEPC水和4℃ PBS缓冲液。冲洗后，将标本置于-80℃的环境下进行保存。

4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测bcl-2和caspase-10 mRNA表达

取约80mg脑组织标本，参照说明书提取总RNA(Trizol法)，微量分光光度计(美国BIO-RAD公司)检测RNA样品浓度(A值)及纯度(A260/A280值在1.7～2.0)并进行标化。逆转录合成cDNA为模板，β-actin为内参照进行实时定量PCR反应(美国BIO-RAD公司的IQ5 RT-PCR仪)。25μL反应体系中包含12.5μL SYBR GREEN，10μLPCR水，0.25μL上游引物，0.25μL下游引物和2μL cDNA。引物序列见表1。反应条件如下：50℃ 2min，95℃ 5min；95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，40个循环。PCR结果采用Ct值比较相对定量法，β-actin为内参照。

表1 实时定量PCR引物序列

5 Western blotting检测bcl-2和caspase-10蛋白表达

对总蛋白质按照说明书标准进行提取，同样地，对其浓度情况用BCA法进行检测。以β-actin为内参蛋白，选取一些蛋白样品进行如下操作，将水煮沸，将已经经过变性缓冲液冲洗的样品放入其中，继续蒸煮5min；……