五倍子粗提液对棉花黄萎病的防治效果

袁媛，冯鸿杰，师勇强，赵丽红，魏锋，冯自力，朱荷琴

（棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所，河南安阳455000）

棉花黄萎病自20世纪90年代以来在我国广大棉区的发生为害日益加重，造成严重的经济损失，是制约我国棉花生产的主要因素之一，但目前仍无非常有效的防治方法。植物源农药是指利用植物有机体的全部或部分有机物质及其次生代谢物质加工而成的制剂，包括从植物中提取的活性成分、植物本身和按活性结构合成的化合物及衍生物；因此，其具有安全无污染、环境友好的特点。目前，已经有多种植物源活性成分的农药取得登记并成功应用，如2.5%（质量分数，下同）鱼藤酮乳油、0.5%楝素乳油等[1]。五倍子（Galla chinensis）系瘿绵蚜科的蚜虫在其寄主漆树科盐肤木属植物的不同部位形成的虫瘿。五倍子的主要化学成分是鞣质类，如五倍子鞣质、缩合没食子鞣质等；还含有脂肪、树脂、蜡质、乌氨酸等[2]，这些化学成分具有较强的抑菌作用[3]。笔者室内测定了五倍子粗提液对棉花黄萎病菌——大丽轮枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）的抑菌活性，并于2016―2017年进行田间试验，研究其对棉花黄萎病的防治效果，为开发防治棉花黄萎病的新型植物源农药提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 棉花黄萎病致病菌菌株

分离自我国黄河流域棉区、长江流域棉区及新疆植棉区的大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080（河北辛集）、Vd147（湖北荆州）和 Vd021（新疆库尔勒）[4]，由本实验室保存。

1.2 棉花品种

耐黄萎病棉花品种鲁棉研21。

1.3 五倍子活性物质提取

五倍子从当地中药材门市购买。将五倍子在50℃的恒温鼓风干燥箱中烘干至质量恒定，然后机械粉碎至粒径0.425 mm。将上述粉碎的五倍子与水按比例混合（质量比为1∶2），浸泡2 h后，于磁力搅拌加热器上，300℃加热煮沸30 min，冷却后经纱布滤出粗提液。向滤渣加入2倍体积的水，重复上述提取过程2遍，将3次所得粗提液合并，即获得五倍子粗提液，于4℃冰箱中保存备用。

1.4 试验方法

1.4.1五倍子粗提液对黄萎病菌菌落生长抑制效果测定。制备查氏培养液：蔗糖30 g、NaNO32 g、Mg-SO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41.31 g、FeSO40.02 g、KCl 0.5g，加入800 mL蒸馏水搅拌溶解，调节pH至7.0，加蒸馏水定容至1 L，分装后，121℃高压灭菌20 min。用于制备大丽轮枝菌孢子液和收集菌丝（添加100 mg·L－1的硫酸链霉素，防止细菌污染）。取100 μL大丽轮枝菌菌液在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基（Potato dextrose agar medium，PDA）上 25℃活化5 d，接入查氏培养液中，震荡培养4～5 d，用血球计数板计数并用无菌水调配至菌液浓度为1×107CFU （Colony forming unit）·mL－1。 制作五倍子粗提液体积分数为0.2%、0.6%和1.0%的PDA，在其中央加入5 μL大丽轮枝菌查氏培养液，于25℃恒温培养，5次重复，分别于5 d、7 d、9 d和11 d后测定菌落直径，以不含五倍子粗提取液的PDA为对照，计算菌落生长抑制率（IG）。计算公式：IG（%）＝（dCK－dT）/dCK×100。 式中：dCK为对照菌落直径，dT为处理菌落直径。

1.4.2五倍子粗提液对大丽轮枝菌孢子产量的抑制效果测定。将含大丽轮枝菌的查氏培养液50 μL接入25 mL含有不同体积分数 （0.2%、0.6%和1.0%）五倍子粗提液的查氏培养液中，于150 r·min－1振荡培养6 d，用血球计数板（每重复查80个小格）测定产孢量，计算产孢量抑制率（IS）。计算公式：IS（%）＝（NCK－NT）/NCK×100。 式中：NCK为对照产孢量，NT为处理产孢量。

1.4.3五倍子粗提液对棉花黄萎病的防治效果试验。2016年以50倍的五倍子粗提液（配以一定比例的分散剂）在棉花黄萎病的发生期7月4日、7月14日、7月24日和8月4日在同一小区持续进行叶面喷雾，于7月14日、7月24日和8月7日和8月17日对棉花黄萎病的发病情况进行调查。在2016年试验结果的基础上，2017年采用40倍、80倍和160倍的五倍子粗提液 （配以一定比例的分散剂）于5月31日、6月12日、6月22日、7月21日进行喷雾，6月29日和7月28日调查黄萎病发生情况。棉花黄萎病苗期病害调查分级标准：0级，健康植株，无病状；1级，1或2片子叶发病，真叶无病状；2级，子叶和1片棉苗真叶表现病状；3级，2片棉苗真叶表现病状；4级，叶片全部都表现病状，顶心枯死[5]。大田试验均在中国农业科学院棉花研究所南场（河南省安阳县）病圃进行，2年试验每次处理均为4行区，小区面积25.6 m2，3次重复，用水量为 450 L·hm－2。

1.4.4五倍子粗提液对棉花产量和纤维品质的影响。2017年棉花吐絮后实收测产，选取30铃检测纤维品质。纤维样品送农业部棉花品质监督检验测试中心进行纤维品质5项指标 （上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度、马克隆值和断裂伸长率）检测（HVICC校准）。

1.5 药效计算方法

病株率（rDP）计算公式：rDP（%）＝NDP/NTP×100。式中：NDP为病株总数，NTP为调查总株数。病情指数（ID，简称“病指”）计算公式：ID＝[∑（NDP(i)×i）/（NTP×5）]×100。 式中：NDP(i)为某一病级病株数，i为相对病级值。

2016年田间试验在棉花黄萎病发生初期喷药，喷药前调查黄萎病发生情况，计算校正防效（EA）。 公式：EA（%）＝[1－（ID(T1)×ID(CK0)）/（ID(T0)×ID(CK1)）]×100。 式中：ID(T0)为施药区药前病指，ID(T1)为施药区药后病指，ID(CK0)为对照区药前病指，ID(CK1)为对照区药后病指。

2017年在黄萎病发生之前喷药，计算相对防效（ER）。 公式：ER（%）＝（ID(T)－ID(CK)）/ID(CK)×100。 式中：ID(T)为施药区病指，ID(CK)为对照区病指。

1.6 数据处理软件及方法

采用Statistix 8进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 五倍子粗提液对大丽轮枝菌生长抑制效果

五倍子粗提液对来自三大棉区的3个强致病力菌株均有较好的抑制效果，而且其菌落生长抑制率（IG）均随着体积分数的增加逐渐提高，到0.6%时，IG均达到100%。不同体积分数五倍子粗提液处理的IG均在第7 d达到最高，第9 d和第11 d，基本维持不变或略下降。在第7 d，0.1%、0.2%和0.6%的五倍子粗提液对Vd080的IG分别为23.2%、59.8%、100%， 对 Vd147的IG分别为31.5%、59.7%、100%， 对 Vd021的IG分别为25.6%、51.8%、100%（表1）。以上结果表明，五倍子粗提液对大丽轮枝菌的生长具有明显的抑制作用，体积分数在0.2%以上时，抑菌效果超过50%；达到0.6%时，能完全抑制大丽轮枝菌菌落的生长。

2.2 五倍子粗提液对大丽轮枝菌孢子产量的抑制效果

五倍子粗提液对3个大丽轮枝菌菌株的产孢量抑制率（IS）均随着其体积分数的增加而提高（表2）。结果表明，五倍子粗提液对大丽轮枝菌的孢子产生具有较好的抑制效果，当体积分数在0.2%以上时，IS超过80%；达到0.6%时，能够完全抑制孢子的产生。

表1 不同体积分数五倍子粗提液处理的大丽轮枝菌菌落生长情况及抑制率

表2 不同体积分数五倍子粗提液对大丽轮枝菌产孢量的抑制作用

2.3 五倍子粗提液对棉花黄萎病防效

2016年采用50倍五倍子粗提液在黄萎病发生期进行叶面喷施，对黄萎病的校正防效为46.5%～55.4%，平均为51.6%，喷施3次后的效果最好（表3）。2017年采用五倍子粗提液40倍液、80倍液和160倍液在黄萎病发生之前开始进行叶片喷施，喷施3次后，3个处理对黄萎病的相对防效分别为25.2%、37.8%和21.2%，80倍液处理显著高于160倍液处理；喷施4次后，3个处理相对防效分别为58.8%、54.3%和25.1%，其中40倍液处理和80倍液处理的相对防效均显著高于160倍液处理，且二者之间差异不显著（表4）。上述结果表明，在黄萎病发生之前或初期采用五倍子粗提液进行叶面喷施，能有效控制棉花黄萎病病情的发展，以40～80倍液效果较好。

表3 2016年五倍子粗提液50倍液叶面喷雾对棉花黄萎病校正防效

表4 2017年五倍子粗提液不同剂量叶面喷雾对黄萎病的相对防效

2.4 五倍子粗提液对棉花产量和纤维品质的影响

五倍子粗提液各处理的棉纤维品质主要指标上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度和断裂伸长率大多比空白对照有所增加，其中40、80倍液能显著提高棉纤维的断裂伸长率，且对其他指标无显著影响（表5）。五倍子粗提液各处理对棉花铃重、衣分、霜前花率无显著影响，但40倍液处理籽棉产量较空白对照提高6.0%，差异达显著水平（表5）。表明，叶面喷施五倍子粗提液能显著提高棉纤维的断裂伸长率和籽棉产量。

表5 不同剂量五倍子粗提液叶面喷雾对棉花纤维品质指标、产量性状的影响

3 讨论与结论

五倍子单宁的低聚体既能结合蛋白质形成氢键,又可以进入微生物的敏感部位从而产生抑制作用；因此，其对细菌和真菌的抑制效果显著[6-7]。室内抑菌试验表明，五倍子粗提液对大丽轮枝菌菌落生长、产孢量的抑制率可达100%，且对不同菌株均具有非常好的抑制效果。田间试验表明，喷施3～4次后其对棉花黄萎病防治效果可达到55.4%～58.8%，与生产上常用的氨基寡糖素、枯草芽孢杆菌和棉萎克防治效果相当[8-10]，且能显著提高棉花纤维的断裂伸长率和籽棉产量。因此，五倍子粗提液在棉花黄萎病防治上具有良好的发展前景。推荐生产上在棉花黄萎病发生前或发生初期叶面喷施40～80倍的五倍子粗提液进行防治。

参考文献：

[1]邵仁志，刘小安，孙兰，等.中国植物源农药的（袁媛，等）五倍子粗提液对棉花黄萎病的防治效果研究进展[J].今日农药，2017（7）：21-24.

[2]江凯.五倍子单宁提取纯化及生理活性的研究进展[J].农产品加工（学刊），2013(10)：53-56，60.

[3]朱荷琴，冯自力，宋晓轩，等.22种中药提取物对棉花黄萎病菌的抑菌活性[J].棉花学报，2007，19(6)：489-492.

[4]朱荷琴，冯自力，尹志新，等.我国棉花黄萎病菌致病力分化及 ISSR指纹分析[J].植物病理学报，2012，42(3)：225-235.

[5]朱荷琴，冯自力，李志芳，等.蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法鉴定棉花品种 （系）的抗黄萎病性 [J].中国棉花，2010，37(12)：15-17.

[6]Tian Fang,Li Bo,Ji Baoping,et al.Antioxidant and antimicrobial activities of consecutive extracts fromGalla chisensis:The polarity affects the bioactivities[J].Food Chemistry,2009,113(1):173-179.

[7]Chen J C,Ho T Y,Chang Y S,et al.Anti-diarrheal effect ofGalla chisensison theEscherichia coliheat-labile enterotoxin and ganglioside interaction[J].Journal of Ethnopharmacology,2005,103(3):385-391.

[8]冯自力，朱荷琴，李志芳，等.氨基寡糖素水剂对棉花黄萎病的防治效果及其使用技术[J].中国棉花，2014，41(7)：11-13.

[9]冯鸿杰，薛中立，郭红甫，等.棉萎克对棉花黄萎病的防控效果及使用技术[J].中国棉花，2016，43(4)：35-37.

[10]师勇强，冯自力，冯鸿杰，等.枯草芽孢杆菌对南疆棉花黄萎病、产量及纤维品质的影响[J].中国棉花，2017，44(12)：8-10.