5 种莲副产物中活性成分及其抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性比较

张 露，黄祥霞，涂宗财,,*，赵 伊，王 辉，王 豪，沙小梅，张恕雅

糖尿病是以持续高血糖为诊断特征的慢性代谢性疾病，血液中的高血糖水平容易引起葡萄糖自氧化和蛋白糖基化，从而导致自由基的过度形成[1]，增加机体中的氧化应激压力，降低抗氧化防御机制，最终促进糖尿病并发症的发生[2]。研究表明，抑制α-葡萄糖苷酶的活性以降低餐后和空腹血糖水平是预防和治疗糖尿病及其并发症的有效方法之一[3]，而清除机体中过度产生的活性氧自由基可在一定程度上缓解糖尿病并发症的发生和发展[2]。

莲（Nelumbo nucifera Gaertn）为睡莲科多年生水生草本植物，广泛分布于中国、印度、韩国、泰国和日本等地。在我国，莲不仅是一种观赏植物和受欢迎的食物，也是一种重要的可用于治疗各种疾病的传统中药，其莲花、莲叶、莲藕、莲子和莲心均可入药，用于治疗如腹泻、呕血、咳嗽、发热、心律不齐和炎症等各种疾病[4]。我国是莲子生产大国，每年8～10月均有大量的莲蓬壳、莲壳和莲衣等副产物被当作废弃物丢弃，这不仅污染了环境，还造成了资源的严重浪费。Qi Suijian等[4]研究发现，莲壳提取物可作为一种潜在的具有抗氧化和抗肥胖功能的天然食品添加剂。Kredy等[5]的研究表明莲壳具有很好的抗氧化活性，且黄酮醇类为其主要活性成分。药理研究表明莲蓬壳具有较强的抗氧化作用[6]，可有效地抑制黑色素瘤细胞B16的增殖[7]，能够改善小鼠学习记忆障碍[8]。陈轩[9]和李绮丽[10]等对莲衣的活性成分和生物活性进行了研究，发现莲衣中含有多酚和黄酮类化合物，具有抗氧化活性。目前鲜有文献比较研究莲叶、莲蓬壳、莲壳、莲衣和莲心中的植物化学成分及其提取物的抗氧化和降血糖潜力。

因此，本实验通过比较莲叶、莲蓬壳、莲壳、莲衣和莲心中多酚、黄酮、三萜和缩合单宁的含量及其提取物的1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）自由基清除能力、2,2’-联氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）自由基清除能力、铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力来研究莲生产主要副产物的抗氧化和降血糖活性及其在相关领域的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜莲叶和莲蓬于2016年9月采集于江西省赣州市石城镇的莲子种植基地，采集后样品用自来水冲洗干净，将莲蓬分为莲心、莲蓬壳、莲壳和莲衣，将所有原料冷冻干燥后粉碎，于4 ℃贮存。

ABTS、DPPH、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG） 美国Sigma公司；没食子酸（gallic acid，GAE）、槲皮素（quercetin，QuE）和所有其他试剂 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-3200紫外-可见光分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；Synergy H1酶标仪 美国Bio-Tek公司；KQ5200DE台式数控超声波清洗器 北京仪诺科兴科技发展有限公司；旋转蒸发仪 日本EYELA公司。

1.3 方法

1.3.1 活性成分提取

采用超声波辅助提取法提取莲心、莲蓬壳、莲壳、莲叶和莲衣中的活性成分。准确称取1.0 g粉末与30 mL 90%（体积分数，下同）甲醇混合，500 W、50 ℃超声处理30 min后，4 000 r/min离心8 min，收集上清液，残渣再在相同条件下提取两次。最后合并所有上清液，减压浓缩后用90%甲醇定容至50 mL。

1.3.2 总黄酮含量的测定

在地基的施工过程中，地下水问题是常见的问题之一。如果对地下水的处理方式不当，不仅会影响地基的质量，还会影响民用建筑的安全。在地基或桩基础的施工过程中，若地下水位较高，应采用合适的排水或止水方法。例如，可采用多桩抽水的方式降低地下水位。而地下水位较低时，可采用单桩抽水的方式，以降低地下水的水位。

采用AlCl3显色法[11]测样品中的总黄酮含量，取100 μL稀释到适宜质量浓度的样品溶液，与100 μL质量分数4% AlCl3·6H2O于96 孔板上混合，室温反应15 min后测其在430 nm波长处的吸光度Ai。用甲醇代替质量分数4% AlCl3·6H2O测得的吸光度为Aj，样品溶液的吸光度ΔA＝Ai-Aj。以槲皮素为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中总黄酮的含量，结果用每克干物质中槲皮素当量表示（mg QuE/g）。重复测定3 次，取平均值。

1.3.3 总酚含量的测定

采用福林-酚法测定总酚含量[12]。取0.2 mL 20 倍稀释的样品与0.1 mL福林-酚试剂混匀，室温反应5 min后，加入0.3 mL 质量分数20% Na2CO3和1.0 mL水，避光反应30 min后取200 μL于96 孔板上，测其在765 nm波长处的吸光度，用水代替福林-酚作空白，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中总酚含量，结果用每克干物质中没食子酸当量表示（mg GAE/g）。实验重复3 次，取平均值。

1.3.4 总三萜含量的测定

根据Uysal等[13]的方法测定样品中总三萜的含量。取500 μL稀释后的样品与0.5 mL 5 g/mL香草醛-冰醋酸和1.0 mL高氯酸混合，60 ℃反应20 min后冰水冷却10 min，加入3.0 mL冰醋酸，室温反应10 min后用紫外-可见分光光度计测定样品在547 nm波长处的吸光度，用不含香草醛-冰醋酸的溶液为空白。以齐墩果酸（oleanolic acid，OAE）为标准品，根据齐墩果酸的标准曲线计算样品中总三萜含量，结果表示为每克干物质中齐墩果酸当量（mg OAE/g）。所有实验重复3 次，取平均值。

1.3.5 总缩合单宁含量的测定

采用香草醛方法测总缩合单宁的含量[14]。取100 μL稀释到适宜质量浓度的样品与0.7 mL新鲜配制的1%香草醛溶液（用7 mol/L浓硫酸配制）混匀，以7 mol/L浓硫酸代替香草醛溶液的反应体系为空白，避光反应15 min后取200 μL于96 孔板上，测其在500 nm波长处的吸光度。以儿茶素（catechin，CaE）为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中总缩合单宁含量，结果表示为每克干物质中儿茶素当量（mg CaE/g）。实验重复3 次，取平均值。

参照按照Zhang Lu等[11]的方法，采用DPPH自由基和ABTS+·两种模型比较莲叶、莲蓬壳、莲壳、莲衣和莲心提取物的自由基清除能力。以槲皮素为对照品，采用Origin 8软件中的多项拟合计算样品清除50%的自由基所需要的样品质量浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.7 FRAP分析

参照Drogoudi等[15]的方法评价样品的FRAP。取10 μL不同质量浓度的样品溶液与250 μL新鲜制备的FRAP溶液（用0.3 mol/L pH 3.6的醋酸盐缓冲液配制的含有10 mmol/L三吡啶基三嗪和40 mmol/L FeCl3的混合液）混合。37 ℃反应10 min后采用酶标仪测定样品在593 nm波长处的OD值。以槲皮素为阳性对照，OD值越高，表示样品的还原能力越强。OD0.3表示使反应体系的OD值为0.3时所需要的样品质量浓度。

1.3.8 α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

按照Zhang Lu等[11]的方法研究样品的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。以阿卡波糖作为阳性对照，通过Origin 8.0软件中的多项拟合计算样品的IC50。

1.4 数据统计与分析

所有实验均重复3 次，结果表示为平均值±标准偏差，利用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，采用皮尔森相关性分析活性成分含量与抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用间的相关性。以P＜0.05表示差异或相关性显著。

2 结果与分析

2.1 总酚、总黄酮、总三萜和总缩合单宁含量分析

表1 5 种样品中的主要化学成分Table 1 Contents of total phenols, total flavonoids, total triterpenoids and total condensed tannins in extracts from five samples

酚类、黄酮类、三萜和缩合单宁是植物中4 种主要的化学成分，因此本研究比较了其在莲叶、莲蓬壳、莲壳、莲衣、莲心5 种提取液中的含量，结果如表1所示。5 种不同提取溶液中总酚、总黄酮、总三萜、总缩合单宁的含量范围分别是44.35～232.50 mg GAE/g、4.84～41.48 mg QuE/g、72.34～423.75 mg OAE/g和1.42～36.13 mg CaE/g。由表1可知，莲蓬壳提取物具有最大的总酚（232.50 mg GAE/g）和总三萜含量（423.75 mg OAE/g），莲心中的总酚（44.35 mg GAE/g）和总三萜含量（72.34 mg OAE/g）最低，分别仅约为莲蓬壳的1/5和1/6。但莲叶、莲壳和莲衣中三萜类化合物的含量相近，且无显著性差异（P＞0.05）。本研究中的总酚含量变化趋势与Wu Yanbin等[16]的报道相似，其研究表明莲蓬壳中的总酚含量高于莲壳、莲叶和莲心。莲叶提取物中的总黄酮含量最高，达41.48 mg QuE/g，而莲蓬壳和莲心提取物、莲壳和莲衣提取物中的总黄酮含量无显著的差异（P＞0.05）。莲衣提取物具有最高的总缩合单宁含量（36.13 mg CaE/g），而莲叶和莲蓬壳次之（P＞0.05）。Chen Sha等[17]的研究表明莲心提取物中的黄酮含量（7.30 mg QuE/g）高于莲叶、莲蓬壳和莲壳，但其值远小于本研究所检测到的黄酮含量。这可能是由于原料的采集时间、地理位置、样品的提取方法和原料的干燥方法的不同所引起[18-19]。冯娟等[20]比较了12 个产地的苹果中总酚含量，发现不同产地苹果中的总酚含量在101.99～177.62 mg/100 g之间。杨鹏等[21]研究了不同产地和不同采集时间对莲叶中芦丁含量的影响，发现来自

湖南、山东等16 个不同产地的莲叶样品中的芦丁含量在1.31～4.08 μg/g之间，而于7～11月5 个不同时间采集的莲叶样品中的芦丁含量为0.71～1.55 μg/g。

2.2 DPPH自由基清除能力分析

图1 5 种样品提取物的DPPH自由基清除能力Fig. 1 DPPH free radical scavenging activity of five extracts

表2 5 种样品提取物的抗氧化能力及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力Table 2 Antioxidant activity and α-glucosidase inhibition of five extracts μg/mL

表3 5 种样品中化学成分与其抗氧化能力、α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的相关性分析Table 3 Correlation coefficients between chemical constituents and antioxidant abilities and α-glucosidase inhibition of five samples

莲叶、莲蓬壳、莲壳、莲衣和莲心的DPPH自由基清除能力如图1所示，其IC50如表2所示。当样品质量浓度从31.25 μg/mL增加至250 μg/mL时，所有样品的DPPH自由基清除能力逐渐增强，且当清除能力低于75%时，样品的DPPH自由基清除能力表现出明显的量效关系。莲蓬壳提取物具有最强的DPPH自由基清除能力，其IC50为54.81 μg/mL，其次是莲衣提取物（IC50为88.96 μg/mL），且莲蓬壳和莲衣提取物对DPPH自由基的清除能力高于阳性对照组槲皮素（IC50为144.48 μg/mL）。莲心提取物的IC50（643.90 μg/mL）最高，说明莲心清除DPPH自由基的能力最低，这可能是由于莲心提取物中总酚、总三萜和总缩合单宁的含量最低所引起。相关性分析显示，DPPH自由基清除能力与样品中总酚、总三萜和总缩合单宁含量有很高的相关性，而与黄酮含量几乎无相关性，其相关系数分别为0.803、0.692、0.700和0.039（表3）。

2.3 ABTS+·清除能力分析

图2 5 种样品提取物的ABTS＋ ·清除能力Fig. 2 ABTS＋· scavenging ability of five extracts

样品的ABTS+·清除能力结果如图2和表2所示，其变化趋势与DPPH自由基清除能力的变化趋势相同，两者之间的相关系数为0.978（表3），显示良好的正相关关系，这可能是由于这两种模型的机制都是评价样品提供氢原子的能力[22]。5 种提取物的ABTS+·清除能力的IC50由小到大为：莲蓬壳＜莲衣＜莲壳＜莲叶＜莲心。莲蓬壳提取物具有最低的IC50（27.84 μg/mL），因此具有最强的ABTS+·清除能力，分别为莲叶和莲心的4.5 倍和14.4 倍，且高于槲皮素（IC50为32.66 μg/mL）。Zheng Lijun等[23]的研究也表明莲蓬壳提取物具有较高的抗氧化能力。相关性分析显示，样品中的总酚含量与其ABTS+·清除能力具有最大的相关系数（r＝0.776），其次是三萜类化合物（r＝0.687）和缩合单宁（r＝0.675）（表3）。所以，样品中的酚类物质对ABTS+·清除能力的贡献最大，三萜类化合物和缩合单宁类化合物次之。许多研究也表明，酚类化合物为植物中清除ABTS+·的主要活性成分[24-25]。

2.4 FRAP分析

图3 5 种样品提取物的FRAPFig. 3 Ferric ion reducing power of five extracts

为验证DPPH自由基和ABTS+·模型测得的结果，采用FRAP实验来评价样品的抗氧化活性。如图3和表2所示，所有提取物均具有明显的剂量依赖性。莲蓬壳提取物具有最高的FRAP，其OD0.3值仅为61.32 μg/mL，其次是莲衣提取物。莲心提取物的FRAP最弱的，当样品质量浓度为0～0.5 mg/mL时，其FRAP随样品质量浓度的增加而增加，且OD0.3值超过1 mg/mL（图中未显示）。另外，样品的FRAP与其清除DPPH自由基和ABTS+·的相关系数分别为0.835和0.871（表3），表明莲子生产副产物的FRAP与DPPH自由基和ABTS+·清除能力有着良好的正相关关系。相关性分析也表明，FRAP与样品中总酚含量的相关性最高，其次是三萜类和缩合单宁类化合物，相关系数分别为0.889、0.832和0.650。Wu Yanbin等[16]的研究也表示，与莲衣、莲叶、莲心比较，莲蓬壳具有较高的DPPH自由基和ABTS+·清除能力，酚类物质为其主要活性成分。结合DPPH自由基和ABTS+·抗氧化模型的实验结果（图1、2和表2）可以得出，莲蓬壳是优于莲叶、莲壳、莲衣和莲心的抗氧化剂资源。酚类、三萜类化合物和缩合单宁是莲蓬壳中主要的抗氧化活性成分。Hu Weicheng等[26]也发现莲蓬壳提取物具有较好的抗氧化活性。

2.5 α-葡萄糖苷酶活性抑制作用

图4 5 种样品提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用Fig. 4 α-Glucosidase inhibition of five extracts

如图4所示，莲叶、莲蓬壳、莲壳和莲衣提取物均具有很强的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，其IC50的变化范围为15.18～176.84 μg/mL，显著高于糖尿病临床治疗药物阿卡波糖（1.29 mg/mL）（P＜0.05）。莲蓬壳具有最高的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，其IC50仅为15.18 μg/mL，其次是莲壳、莲衣，这3 种样品抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力分别为阿卡波糖的85 倍、32.9 倍、21.7 倍。Huang Chunfa等[27]研究发现莲叶及其活性成分儿茶素能有效控制II型糖尿病小鼠的血糖水平。然而，莲心提取物对α-葡萄糖苷酶活性起着促进作用。Kato等[28]发现莲心能促进小鼠对葡萄糖的吸收，从而提高血液中血糖水平，且去甲乌药碱4’-O-β-D-葡萄糖苷为其活性成分，这可能是莲心促进α-葡萄糖苷酶活性的原因。但为探明莲心促进α-葡萄糖苷酶活性的具体成分和作用机制，需要开展进一步研究。

3 结 论

针对当前莲子生产副产物利用率低、附加值不高的现状，本实验比较研究了莲心、莲蓬壳、莲壳、莲叶和莲衣5 种莲子生产副产物中总酚、总黄酮、总缩合单宁和总三萜含量及其提取物的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。结果表明，莲蓬壳提取物有最高的总酚和总三萜含量；莲叶提取物中的黄酮类化合物含量最多，而莲衣具有最高的总缩合单宁含量。抗氧化活性分析显示，莲蓬壳提取物的自由基清除能力、FRAP和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力最强，且其抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力约为阿卡波糖的85 倍，酚类、三萜和缩合单宁为莲叶副产物中的主要抗氧化成分。以上结果表明，莲蓬壳可以作为一种潜在的天然抗氧化和降血糖资源，具有开发为预防糖尿病及其并发症的保健品的潜力。本研究对促进莲子副产物的深入研究和高值化利用具有重要参考价值。

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