利用酵母双杂交系统从人胚胎肝脏cDNA文库中筛选与JNKK2相互作用的蛋白

孙杰，常正尧，张晓明，王晶

1.军事科学院 军事医学研究院 毒物药物研究所，北京 100850；2.解放军第302医院，北京 100039；3.空军军医大学，陕西 西安 710032

c-JunN 端激酶激酶 2（c-JunN-terminalki⁃nasekinase2，JNKK2）是 c-JunN端激酶（c-Jun N-terminalkinase，JNK）的上游激酶，也被称为丝裂原激活的蛋白激酶激酶7（mitogen-activated proteinkinasekinase7，MKK7），其调控着机体内众多生理进程，包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡等[1-2]。既往研究及我们课题组前期的工作发现，JNKK2分子参与调控多种肿瘤的恶性增殖[3-6]。然而目前有关JNKK2在肝脏中的功能及调节机制研究还较少。酵母双杂交系统是一种可以快速、直接分析已知蛋白之间相互作用的常用方法，可用于分离与已知蛋白存在相互作用的配体，并明确其编码基因。该系统具有简便、高效、灵敏等特征，并能反映不同蛋白在细胞内的相互作用，常被用于基因的功能研究[7-8]。因此，为了探究JNKK2在肝脏中的调节机制，我们利用酵母双杂交系统，从人胎肝cDNA文库中筛选出能与JNKK2相互作用的蛋白，期望找到调控JNKK2-JNK信号通路的新分子，进而为更好地理解JNK信号通路在肝脏中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

JNKK2KM质粒、GFP-JNKK2质粒由本室张纪岩教授提供[4]；酵母菌株 AH109（MATa），诱饵载体质粒pGBKT7，文库载体质粒pGADT7，对照质粒 pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-T、pCL1，预转化的人胚胎肝脏cDNA文库，营养缺陷型培养 基 ，X-α-gal，抗 GAL4DNA-BD 多 抗 购 自Clontech公司；YPDA培养板购自青岛海博生物科技有限公司；鲑鱼精DNA（CarrierDNA）、玻璃珠、3-AT、PEG3350、溶壁酶、苯甲脒、DMSO、PMSF、抗Flag标签抗体购自Sigma公司；无氨基酸酵母氮源（YNB）购自Difco公司；蛋白A/G琼脂糖珠购自SantaCruz公司；DNA聚合酶Pyrobest及其缓冲液、dNTPs购自TaKaRa公司；各种限制性内切酶及相应缓冲液购自NewEnglandBiolabs公司；……