EGFP-MAD2融合基因表达载体的构建及功能验证

于晓晨，梁剑青，王嫚娜，牛祖彪，陈昭烈，孙强

军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

细胞内的着丝粒相关蛋白检查点蛋白（checkpointprotein，CP）是细胞分裂监控体系中的重要组成部分，有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitoticarrest deficientprotein2，MAD2）作为CP蛋白的重要成员，在控制有丝分裂周期的正常进行中发挥着重要作用[1-2]。MAD2可以与CDC20结合[3]，共同参与有丝分裂纺锤体检查点复合物（spindleassemblycheckpoint，SAC）的形成[4]，抑制有丝分裂中期向后期的进展，防止染色体分离错误。当有丝分裂中期姐妹染色单体正确地连接于纺锤体上，MAD2与CDC20解离，SAC复合物失活，CDC20激活泛素连接酶分裂后期促进复合体或循环体（APC/C），促进细胞周期阻滞蛋白的降解，有丝分裂中期向后期正常进展；若有丝分裂中期异常，则会激活SAC复合物，将细胞阻滞在分裂中期[5-6]。MAD2的异常会导致纺锤体检查点的功能减弱或消失，无法监控肿瘤细胞内异常的动粒-微管结合，使染色体出现异常分离，造成细胞核型的非整倍体异常而导致肿瘤[7-8]。因此，MAD2与肿瘤的发生密切相关[4]。

为动态追踪细胞有丝分裂中期阻滞，实时标记周期阻滞的细胞，并检测MAD2分子在细胞分裂周期里的亚细胞分布变化，我们构建了MAD2与绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白，并初步检测了EGFP-MAD2融合蛋白表达对细胞周期的影响。结果表明所构建的重组质粒能够有效表达EGFP-MAD2融合蛋白，并诱导细胞在G2/M其发生阻滞，为随后的功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞293FT细胞由本实验室保存；大肠杆菌感受态细胞Trans10、dNTPs、TaqDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；……