人血小板衍生生长因子BB亚型包涵体复性与纯化

孙卫国，郑本献，熊志红，杨秉芬，刘艳华，张灵霞

1.解放军第309医院 结核病研究所，全军结核病防治重点实验室，结核病诊疗新技术北京市重点实验室，北京 100091；2.军事科学院 第61研究所门诊部，北京 100141

血小板衍生生长因子（platelet-derived growth⁃factor，PDGF）是由细胞产生的肽类生长因子，与受体结合后，通过Ras/GTP激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路，促进细胞的有丝分裂[1]。PDGF参与机体组织的生长发育、创伤愈合，肿瘤的发生、发展及动脉粥样硬化等[2]。在PDGF所有亚型中，PDGF-BB行使PDGF的主要功能，在创伤愈合的各个阶段发挥重要作用[3]。PDGF-BB能加速成骨细胞内的DNA合成与修复，刺激成骨细胞的复制和胶原降解，从而促进骨折造成的创伤愈合[4]。目前利用原核表达系统规模化生产PDGF-BB细胞因子的主要困难是表达量非常低，复性率不高，纯化条件不稳定，生物活性也不高。本实验室根据原核表达特点，参照生物信息学和软件Vector NTI suitor7.0分析结果，提高了PDGF-BB的表达量，占菌体总蛋白的25%[5]。在此，我们对基因工程下游技术进行探索，对PDGF-BB包涵体的变性、复性方法和条件，以及纯化工艺的优化进行多次尝试，提高了PDGF-BB包涵体的复性率达40%以上，同时稳定了重组蛋白的纯化工艺，获得了纯度大于95%且具有良好生物活性的重组PDGF-BB蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

NIH3T3细胞株、宿主菌株大肠杆菌BL21（DE3）、表达载体pET-PGDF-BB由本室保存。酵母提取物、胰蛋白胨购自Oxoid公司；PDGF-BB标准品购自中国药品生物制品检定所；PDGF-BB抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标羊抗兔IgG购自Ab⁃cam公司；层析用填料SP SepharoseFF、分子筛填料Sephacryl S300购自GE公司；FPLC蛋白纯化分离系统购自Bio-Rad公司；……