SCoT分子标记对不同产地白芍亲缘关系的研究△

席秀利，胡珊，邬龙怡，钟旺琴

(广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663)

白芍，别名芍药，《中华人民共和国药典》2015版载其原植物为毛茛科芍药属植物芍药PaeonialactioraPall.的干燥根。其性味苦、酸，微寒。归肝、脾经。养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳。用于血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗，胁痛，腹痛，四肢挛痛，头痛眩晕等症[1]。白芍主产于中国安徽、四川、浙江、山东等地[2]。浙江磐安、安徽亳州、四川中江和山东菏泽作为白芍的传统产区，在长期的引种和交流中，种质资源较为混杂，导致白芍种质资源的遗传结构有较大程度的差异，品种退化严重，栽培种质混杂[3]。白芍是中国传统常用大宗中药材，需求量大，且品种繁多，而种质资源的混杂严重影响了白芍规范化生产的发展。因此有必要从源头即白芍种质资源、种植规范方面严格要求，搞清白芍药材的地道性，建立品种质量标准，从而指导GAP中药材生产质量管理规范标准化生产。

目标起始密码子多态性分子标记(Start codon targeted polymorphism，SCoT)是Collard和Mackill开发的基于SPAR(单引物扩增反应)的新的目的基因分子标记方法。其原理是根据植物基因中ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性设计单引物，对基因组进行扩增，产生偏向候选功能基因区的显性多态性标记[4]。SCoT标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点，操作简单，成本低，引物设计简单且可以通用，多态性丰富，可用于分子辅助育种[5]。目前SCoT已被成功应用于柑橘[6]、铁皮石斛[7]等作物，在种属间、品种间的遗传多样性分析及杂交后代的遗传分析等研究中取得较多进展。本研究利用SCoT分子标记对四川中江、浙江磐安、安徽亳州、山东菏泽四大传统产地的22个居群的白芍样品进行亲缘关系研究和遗传多样性检测。目的是从分子水平上研究22个白芍居群的亲缘关系及遗传多样性，为白芍药材的引种和栽培提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采集来自浙江，安徽，四川，山东共22个不同居群白芍样品，经广州中医药大学黄海波副教授鉴定为白芍PaeonialactioraPall.，凭证标本保存于香雪制药有限公司研发中心。详细记录样品信息及编号，用75%乙醇清洁叶表面后保存于-80 ℃冰箱备用，具体样品信息如下。

表1 样品信息表

1.2 仪器和试剂

分析天平，核酸蛋白测定仪(Implen Nanophotometer)，PCR仪(BIO-RAD)，离心机(Eppendorf)，超低温冰箱(Thermo 902-ULTS)，电泳仪、电泳槽(BIO-RAD)，制冰机，水浴锅，凝胶成像仪(BIO-RAD)。

dNTPs、ExTaqDNA聚合酶、Mg2+、10x ExTaq Buffer、Loing Buffer(Takala)，Maker3(广州东盛生物科技有限公司)，琼脂糖(Biowest)，Golden View核酸染料(北京博凌科为生物科技有限公司)，TAE(50×)(生工)，植物基因组提取试剂盒(天根生化)，参考Collard和Mackill提供的36条SCoT引物序列。

2 方法

2.1 基因组DNA提取与检测

采用天根植物基因组试剂盒提取所有材料的基因组DNA。用微量紫外核酸仪检测DNA浓度和纯度。将合格样品DNA浓度稀释至20 ng·μL-1后置于-20 ℃保存备用。

2.2 SCoT-PCR 反应体系正交优化

选用L16(54)正交试验设计(表2)，对Mg2+、dNTPs浓度、ExTaq DNA聚合酶、引物和DNA用量进行5因素4水平的正交试验。以山东编号为J的DNA为模板，随机挑选S6号引物作为扩增引物，反应总体积20 μL，含有10×PCR Buffer 2 μL，每个处理重复2次。

表2 PCR反应正交体系浓度表

2.3 SCoT-PCR引物筛选

根据正交试验结果选择最佳反应体系对36条引物进行筛选，设平行组。

2.4 退火温度筛选

对筛选后的引物进行温度筛选，在PCR仪上设定50 ℃～60 ℃温度区间，即50 ℃，50.9 ℃，52.3 ℃，54 ℃，56.3 ℃，58.1 ℃，59.3 ℃，60 ℃，8个温度梯度进行退火温度筛选。

2.5 SCoT-PCR反应体系的验证与多态性引物筛选

选择浙江、四川、安徽三个不同产地的白芍DNA为模板，按照上述优化的SCoT-PCR体系进行SCoT分子标记，筛选出多态性好、条带清晰的引物。

2.6 SCoT-PCR 扩增与检测

PCR扩增反应在PCR仪上进行，扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。扩增反应结束后，取10 μL扩增产物加入2 μL 6×loading buffer用2.0%琼脂糖凝胶，在1XTAE电极缓冲液，120 V，30 min电泳下检测条带，凝胶成像仪下拍照。

2.7 数据分析

根据PCR扩增产物的电泳结果，对清晰且易于辨认的条带采用“0/1”系统记录其位置，建立SCoT标记的0/1矩阵。用NTSYS-pc2.10 e软件计算样品间的相似系数，并用不加权成对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析。

3 实验结果

3.1 DNA提取结果

将提取的所有样品在超微量紫外分光光度计下测量其浓度和纯度，得到其A260/A280均在1.7～2.0之间，说明DNA纯度较高，符合PCR技术要求。

3.2 SCoT-PCR反应体系正交优化结果分析

使用引物S6对反应体系优化的电泳结果见图1，参考桂腾琴[14]直观评价法依次对16个实验组结果多态性进行评分，条带数量丰富、清晰的计16分，涂布或无条带的计1分，反应1～16组体系的平均整数计分依次为：4、8、5、9、7、12、7、6、8、9、3、10、5、15、16、14分。依照计分原则，以第15组计分最高，条带最为清晰明亮。因此考虑体系最终为1×PCR buffer，3 mmol·L-1Mg2+，0.2 mol·L-1dNTPs，0.6 μmol·L-1primer，0.75 U ExTaq酶，30ngDNA模板。

注：1～16分别为正交1～16组不同PCR反应体系。图1 SCoT正交体系优化电泳图

3.3 引物筛选及退火温度优化

以最佳反应体系对36条SCoT通用引物进行筛选，重复2次初筛选出14条引物见下图2，进行8个退火温度梯度筛选，根据信号强度判断条带，采用区间温度对筛选的引物进行匹配最终获得在53 ℃，56 ℃，57 ℃，59 ℃四个温度扩增下的13条引物。其中S29和S30号引物的退火温度梯度筛选如下图3。

注：1～36分别为S1～S36号引物。图2 36条引物初筛电泳图

注：1～8分别为50 ℃～60 ℃梯度温度。图3 S29和S30在8个温度梯度下扩增电泳图

3.4 SCoT扩增的多态性分析

以浙江，四川，安徽三个地域差异大的样品对退火优化后的13条引物进行多态性筛选，最终获得12条扩增带型完整、清晰、多态性丰畗的引物(表3)。利用这12条引物对24份材料进行SCoT扩增，共获得总条带121条，其中多态性条带共77条，多态位点百分率共占63.6%，多态性比率较高，在分子水平证实了白芍具有丰富的种内遗传多样性。

注：a.安徽白芍；b.四川白芍；c.浙江白芍。图4 部分SCoT引物多态性筛选

表3 SCOT引物扩增结果

注：1～22为样品表中依次排序的A1～J号样品。图5 S6引物对22份材料SCoT-PCR扩增电泳图

注：1～22为样品表中依次排序的A1～J号样品。图6 S25引物对22份材料SCoT-PCR扩增电泳图

3.5 SCoT标记的遗传相似性及聚类分析

利用NTSYS软件构建全部材料基于SCoT数据的UPGMA树状图，结果如图7。22份材料两两之间的相似系数在0.78～0.94之间，以相似系数0.82为阈值可将22份材料划分为5组，浙江的4个样品Z1-Z4聚为一支；四川的4个样品C3、C4、C5、C6聚为一支；安徽A1、A2与四川C1、C2聚为一支，说明安徽与四川白芍亲缘关系较近，从地理位置分析可能由于白芍地方引种和杂交导致，因此安徽白芍与四川白芍差异不大；山东B、C、J三个样品聚为一支，且与四川和安徽白芍亲缘关系较近，可能因山东白芍多来源于栽培，而栽培品种来源混杂，从聚类树上可以初步认为部分山东白芍由四川或者安徽引种得来；剩下7个的山东样品则聚为一组。

图7 22个不同产地白芍样品的聚类分析图

4 讨论

近年来，采用分子生物技术对药材鉴别已成为趋势，目前白芍及品种的分子鉴定仅出现AFLP[9]、RAPD[10-11]、ISSR[12-13]、DNA条形码[14]的研究，然而尚未有关SCoT标记在白芍亲缘关系鉴定中应用的研究报道。其中周佐斌[11]使用ISSR分析对白芍种质资源的遗传多态性性分析，主要对浙江磐安白芍为主要研究对象，并以花色特征的种内变异为研究内容，发现浙江磐安白芍与外省居群分支明显。徐攀[13]等人采用DNA条形码技术和随机多态性RAPD分子标记技术对12个不同品种的白芍种质资源进行遗传多样性研究，发现DNA条形码分子标记在种内水平中并不能很好的区分相关的品种和品系，而RAPD分子标记的结果也证明了现有的白芍种质资源中存在较为丰富的遗传多样性。

SCoT标记作为一种新型的目的基因分子标记，结合了ISSR和RAPD的优点，操作简单、重复性好、引物通用性强，实验成本较低。本实验从36条SCoT通用引物中最终筛选出12条清晰、条带丰富的作为不同产地白芍的SCoT分子标记的引物，验证了其稳定性及可靠性。引物扩增多态位点百分率占63.6%，在分子水平证实了不同产地白芍具有丰富的种内遗传多样性，本研究通过NTSYS软件进行相似系数和UPGMA聚类分析，实现了对不同产地白芍22份样品的初步区分。不同地区白芍样品在聚类树上基本聚为一类，浙江、安徽白芍在聚类图上的聚类相对明显，且同产地内的白芍相似系数高。而安徽白芍与四川部分白芍则出现混种现象，同时部分山东白芍样品与安徽，四川两地部分样品亲缘关系近，这可能由于白芍经过短期引种和驯化导致品种间混杂现象。这对比研究结果表明SCoT技术能从分子水平上检测不同产地和居群之间白芍的基因差异，可以从基因水平把不同地区植株外型相似的白芍品种区分开，对新品种的选育有很大的意义。

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