电针丰隆穴对非酒精性脂肪肝病大鼠肝脏p-PERK、p-IRE1α及炎性因子的影响❋

余 敏，唐成林，冯启廷，高睿琦，曹 净

(1. 重庆市北碚区中医院，北碚 400700； 2. 重庆医科大学中医药学院，重庆 400016)

非酒精性脂肪肝病是一种遗传-环境-代谢应激性肝脏损伤综合症，以肝实质细胞脂肪变性与脂肪贮积为病理学特征[1]。目前高脂饮食导致的非酒精性脂肪性肝病的发病率越来越高。最近的调查发现，在我国成年人群中NAFLD患病率接近15% (6.3%～27.0%)[2]。既往对于非酒精性脂肪肝病的研究多集中在脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗、氧化应激等方面。近期研究证实，内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与其发病密切相关[3]。ERS时未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR) 可导致肝脏脂质代谢紊乱和肝细胞凋亡，最终导致NAFLD[4]。蛋白激酶样内质网激酶(PERK)和内质网跨膜激酶1(IRE1)是UPR的关键信号分子[5]，且PERK、IRE1信号通路在内质网应激与炎症反应的连接中发挥着重要作用[6]。

近年来，针刺治疗非酒精性脂肪肝病在临床中取得了较大的进展，且实验证实电针可以改善脂质代谢紊乱[7-9]。“丰隆”穴属于祛痰要穴，在临床上是治疗肥胖、脂代谢紊乱的经验穴，但电针“丰隆”穴能否改善内质网应激与炎症反应，以达到治疗非酒精性脂肪肝病的作用机制尚不明确。故本实验通过高脂饮食诱导NAFDL模型大鼠，观察电针“丰隆”穴对NAFLD大鼠肝细胞病理形态变化和血清FFA、TG及肝脏TNF-α、IL-6、p-PERK、p-IRE1α的影响，探讨电针改善NAFLD大鼠内质网应激与炎症反应信号通路的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

70只SPF级8周龄雄性SD大鼠，购自重庆医科大学动物实验中心(实验动物合格证号SCXK渝2012-0002)，饲养于重庆医科大学动物实验中心SPF级动物房，环境安静，室温(22±2) ℃，自由饮水和摄食。

1.2 主要试剂与仪器

猪油及基础饲料(重庆医科大学动物实验中心)，胆固醇、胆酸钠、丙硫氧嘧啶(北京索莱宝科技有限公司)，蔗糖(成都科龙化工试剂厂)，FFA、TG测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；p-PERK一抗(美国Cell Signaling Technology公司)、p-IRE1α一抗(美国Novus Biologicals公司)，二抗：HRP辣根过氧化物标记生物素(北京博奥森生物技术有限公司)；TRNzol总RNA提取试剂及DL2000Marker(北京天根生化科技有限公司)，RNA逆转录试剂盒(日本TOYOBO公司)，GAPDH、TNF-α、IL-6引物(上海生工生物工程有限公司)。

低温离心机(美国SIGAM公司)，PCR system 7500(美国Applied Biosy Stems公司)，CFX PCR仪(美国Bio-Rad公司)，华佗牌针灸针(0.25 mm×15 mm)及华佗牌SDZ-Ⅱ型电针仪(苏州医疗用品厂有限公司)，Chem GelDocXR凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型的建立及分组 参照文献[7]建立大鼠非酒精性脂肪肝病模型，70只大鼠适应性喂养1周，按随机数字表法选取15只作为普通饮食组，饲以普通基础饲料；其余55只作为高脂造模组，饲以高脂饲料(胆固醇2%，胆酸钠0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，猪油10%及普通基础饲料82.3%)建立NAFLD模型大鼠。5周后普通饮食组、高脂造模组分别随机抽取2只大鼠脱颈处死，取肝脏组织做HE染色，观察肝细胞形态学变化，验证造模是否成功。HE染色显示，普食组大鼠肝细胞结构清晰，排列整齐，仅存在极少量脂滴；而高脂造模组肝细胞排列紊乱，胞浆疏松，可见大量脂滴，呈大泡型脂肪变性，表示造模成功。从余下的普食组中随机选取12只作为普食组(C)，将高脂造模组中随机选取12只为高脂对照组(HF)，12只为手针“丰隆”组(AF)，12只为电针“丰隆”组(EAF)，12只为电针“足三里”组(EAZ)。普食组继续喂养普通基础饲料，其余各组继续喂养高脂饲料。

1.3.2 干预方法 普食组和高脂对照组大鼠每天只进行固定，不给予针刺干预。手针“丰隆”组和电针“丰隆”组选取两侧“丰隆”穴进行针刺，电针“足三里”组选取两侧“足三里”穴进行针刺。穴位的定位参照李忠仁《实验针灸学》[10]，0.25 mm×15 mm毫针匀速进针，直刺5 mm。电针“丰隆”组与电针“足三里”组针刺后连接电针仪，电针强度5mA，疏密波(疏波频率4 Hz，密波频率20 Hz)[11]，每日1次，每次留针20 min，连续干预4周。干预期间普食组继续普通饲料喂养，其余各组继续高脂饲料喂养。实验动物的处置遵循中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规定，且符合重庆医科大学伦理委员会标准。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 血清FFA、TG测定 干预结束后，各组大鼠禁食过夜，10%水合氯醛麻醉，心脏取血3 ml静置20 min，离心机分离血清(3000 r/min)保存于4 ℃冰箱，采用酶标仪比色法检测血清FFA，GPO-POD酶法检测血清TG，具体检测方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.2 HE染色法观察肝脏细胞病理形态变化 取肝脏左叶组织经4%多聚甲醛固定，酒精梯度脱水后浸蜡包埋、切片，二甲苯和无水乙醇进行切片脱蜡、染色、复染，脱水后中性树胶封片。上述实验操作由重庆医科大学基础医学院组织切片室完成，在重庆医科大学生命科学院光镜下观察采集图像。

1.4.3 肝脏p-PERK、p-IRE1α蛋白和TNF-α、IL-6 mRNA表达 麻醉后迅速取肝组织放入液氮，-80 ℃冰箱冻存备用。1) Western-blot法检测肝脏p-PERK、p-IRE1α蛋白表达：将100 mg大鼠肝脏组织剪碎，加入0.2 ml RIPA和2μLPMSF，用匀浆器于冰上充分匀浆。在冰上裂解30 min后移入离心管，4 ℃ 20000 g离心30 min。然后将上清液转移至1.5 ml离心管中，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品和样品缓冲液以4∶1的比例混合，沸水浴5 min后上样。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜。将膜置于5%的脱脂牛奶封闭液中，于摇床上封闭1 h，PBST漂洗 3次；加入一抗(稀释比例p-PERK:1∶1000，p-IRE1α:1∶1000)4 ℃孵育过夜，取出一抗PBST漂洗3次，每次10 min；加入辣根过氧化物标记的二抗，摇床轻摇1 h，TBST室温脱色摇床上洗3次，每次10 min。化学发光反应、显影、定影。凝胶成像仪扫描分析，以目的条带和内参条带的灰度比值代表p-PERK和p-IRE1α在肝脏组织中的表达水平。2) RT-PCR法检测肝脏TNF-α、IL-6 mRNA表达：取大鼠肝脏组织约50 mg，按TRNzol试剂说明书提取组织总的RNA，用紫外分光光度计检测RNA的浓度及OD260/OD280的比值。按Rever Tre Ace-a-逆转录试剂盒说明书将取2μg总RNA为模板逆转录为cDNA。反应条件为：42 ℃→10 min→30 ℃→20 min～99 ℃→5min→4 ℃→5min。引物设计与合成：TNF-α上游引物：5’-GCGCCCAGCCTTCCTTACG-3’；下游引物：5’-CCCCCGGCCTTCCAAATAAATAC -3’,PCR产物152 bp；IL-6上游引物：5’-CCCACCAGGAACGAAAGTCAAC-3’；下游引物：5’-CCATTGCACAACTCTTTTCTCATT-3’,PCR产物103 bp；内参GAPDH上游引物:5’-GGGGTGATGCTGGTGCTGAGTATG-3’，下游引物：5’-CCGCCTGCTTCACCACCTTCT、T-3’，PCR产物538 bp。将TNF-α、IL-6及GAPDH引物与逆转录产物在20 μL反应体系中进行PCR扩增。反应条件：96 ℃预变性5 min，96℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，循环40次，72 ℃延伸10 min。反应结束后，取15 μL反应产物琼脂糖凝胶电泳，GelDocXR凝胶成像仪进行扫描，Quantity One软件对条带进行灰度分析，计算TNF-α和IL-6 mRNA的相对表达量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 观察各组大鼠的一般情况及肝脏细胞病理形态

实验期间普食组大鼠毛发整洁有光泽，活动灵活，饮食、水正常，排泄物正常，体质量稳定增加；高脂组大鼠活动减少，皮毛凌乱，饮食、水正常，排泄物油腻，体质量增长比普食组多；各干预组大鼠体质量均增长缓慢，活动稍增多，皮毛呈浅黄色，排泄物较正常。

图1显示，HE染色后光镜下观察普食组大鼠肝细胞排列整齐、肝小叶结构清晰，肝窦正常，偶见少量细胞内存在脂滴；高脂对照组大鼠肝细胞排列紊乱，体积变大，胞浆疏松，细胞内见大量大泡型脂肪空泡，胞核偏移；手针“丰隆”组肝细胞肿胀，内见小泡型脂滴，较高脂对照组减轻；电针“丰隆”组与电针“足三里”组肝细胞排列有序，细胞脂肪变性程度较高脂对照组明显下降，肝细胞结构接近正常。

图1 HE染色显示各组大鼠肝脏细胞病理变化(×40)

2.2 各组大鼠血清FFA、TG含量比较

表1显示，高脂对照组大鼠血清FFA、TG含量显著高于普食组(P<0.01)；干预后手针“丰隆”组、电针“丰隆”组与电针“足三里”组大鼠血清FFA、TG含量较高脂对照组显著降低(P<0.01)；与手针“丰隆”组比较，电针“丰隆”组血清FFA、TG含量显著降低(P<0.01)；电针“丰隆”组血清FFA含量低于电针“足三里”组(P<0.05)，而血清TG含量在电针“丰隆”组与电针“足三里”组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组大鼠肝脏组织中p-PERK和p-IRE1α蛋白表达比较

图2表1显示，高脂对照组大鼠肝脏p-PERK和p-IRE1α蛋白表达显著高于普食组(P<0.01)；手针“丰隆”组、电针“丰隆”组与电针“足三里”组大鼠肝脏p-PERK和p-IRE1α蛋白表达显著低于高脂对照组(P<0.01)；电针“丰隆”组大鼠肝脏p-PERK和p-IRE1α蛋白表达低于手针“丰隆”组(P<0.05)；电针“丰隆”组大鼠肝脏p-PERK低于电针“足三里”组(P<0.05)，而p-IRE1α蛋白在电针“丰隆”组与电针“足三里”组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 大鼠各检测指标表达情况

注:与普食组比较:##P<0.01；与高脂对照组比较:**P<0.01；与手针“丰隆”组比较:△P<0.05,△△P<0.01；与电针“丰隆”组比较:☆P<0.05

图2 各组大鼠肝脏p-PERK和p-IRE1α蛋白表达比较注:C.普食组；HF.高脂对照组；AF.手针“丰隆”组；EAF.电针“丰隆”组；EAZ.电针“足三里”组

2.4 各组大鼠肝脏TNF-α和IL-6 mRNA表达比较

图3和表1显示，高脂对照组大鼠肝脏 TNF-α和IL-6 mRNA表达显著高于普食组(P<0.01)；手针“丰隆”组、电针“丰隆”组与电针“足三里”组大鼠肝脏TNF-α和IL-6 mRNA表达显著低于高脂对照组(P<0.01)；电针“丰隆”组大鼠肝脏TNF-α和IL-6 mRNA表达显著低于手针“丰隆”组(P<0.01)，且电针“丰隆”组表达低于电针“足三里”组(P<0.05)

图3 各组大鼠肝脏TNF-α和IL-6 mRNA表达比较注:C.普食组；HF.高脂对照组；AF.手针“丰隆”组；EAF.电针“丰隆”组；EAZ.电针“足三里”组

3 讨论

NAFLD患者往往伴有肥胖或代谢紊乱，又被视为代谢综合征及糖尿病的肝脏表型，肥胖和糖脂代谢紊乱会直接导致代谢性炎症，炎症又可以促进脂质在组织细胞内的过度沉积，并导致肝脏的脂变性及损伤[12]。在NAFLD发病过程中，脂代谢紊乱和炎症反应可能引起或是加重内质网中出现一些紊乱的状态，如Ca2+平衡紊乱和错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集,这种紊乱状态被称为内质网应激(ERS)[13]。ERS的表现包括未折叠蛋白反应(UPR)、内质网相关性死亡和整合应激反应3个相互交联的动态过程，主要是UPR[14]。UPR是机体对抗内质网应激的保护性机制[15]，它激活3条典型的信号通路，即蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、内质网跨膜激酶1(IRE1)和激活作用转录因子 (ATF6),在生理状态下PERK、IRE1、ATF6以无活性的状态与内质网分子伴侣重链结合蛋白结合，发生ERS时内质网稳定失衡，重链结合蛋白与3种感应蛋白分离，游离的PERK、IRE-1分别通过各自细胞质内结构域的二聚化和自身磷酸化而受到激活[16]。因此，PERK及IRE1通过跨膜磷酸化而传导ER应激反应信号是ERS存在的核心指示物。研究表明，内质网应激时PERK和IRE1α磷酸化水平显著升高，与肝脏脂质沉积有关[17-18]。此外，内质网应激时UPR 通路中PERK和IRE1均能导致 NF-κB-Iκ-B 的激活，进而诱导炎性反应相关分子的表达[19]。其中NF-κB是炎性反应的中心转录因子之一，参与多种炎症基因的转录调控，在炎症反应中发挥重要作用。如它可调控TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8等炎症反应分子的转录；另一方面，炎性细胞因子可以引起微环境的改变，从而影响蛋白折叠调节内质网应激[20]。由此可见，在肝脏脂代谢紊乱中内质网应激与炎症反应紧密相关，且其关联也不是单方面的。炎症因子的激活也能加重内质网功能的损害，由此使机体处于恶性循环之中，致肝脏遭受多重打击导致非酒精性脂肪肝病的发生发展。

中医认为，NAFLD主要病机为肝脾气化失司、痰浊内蕴、湿邪内生，致肝脾肾功能失调，终致气滞、血瘀、痰湿相互搏结，痹阻于肝脏脉络而成。非酒精性脂肪肝病中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的升高，可以看作是痰瘀的物质基础和外在表现[21]。“丰隆”穴出自《灵枢·根结》[22]：“足阳明根于厉兑,溜于冲阳, 注于下陵, 入于人迎, 丰隆也”，类属足阳明胃经络穴, 联络胃脾二经, 因此针刺该穴具有“一络通二经”之效，能疏通表里两经之气血、和胃健脾、化痰利湿，为祛痰要穴。既往研究表明，电针“丰隆”穴对高脂血症有治疗作用[23]。近期研究还发现，电针“丰隆”穴能够明显下调高脂血症大鼠血脂水平，降低肝脏组织中炎症因子TNF-α蛋白水平[24]，还可调节肝脾肾功能，防止肝细胞脂肪过度沉积、变性，改善和治疗非酒精性脂肪性肝炎[25]。

本研究选取“丰隆”穴，采用手针及电针组作对比，再选取“足三里穴”给予电针与电针“丰隆”作对比，采用高脂饲料复制NAFLD模型大鼠，结果显示高脂对照组大鼠肝脏细胞出现明显脂肪变性，血清FFA、TG及肝脏p-PERK、p-IRE1α、TNF-α及IL-6表达显著高于普食组，表明高脂对照组大鼠肝脏脂代谢紊乱，处于内质网应激、炎症损伤状态；单纯针刺与电针干预后肝脏细胞脂肪变性减轻，且各组血清FFA、TG及肝脏p-PERK、p-IRE1α、TNF-α及IL-6表达较高脂对照组显著下调，提示单纯针刺及电针对脂代谢紊乱、肝脏内质网应激与炎症损伤状态均有良性调节作用，能改善内质网应激，减轻炎症反应，调节脂质代谢与肝脏脂肪沉积变性。其中研究发现，2电针组干预效果优于单纯针刺组，且电针“丰隆”组效果较电针“足三里”组更优，表明电针“丰隆”穴对NAFLD的改善效果更为显著，但2电针组TG、p-IRE1α比较差异无统计学意义，考虑可能 “丰隆”穴、“足三里”均位于足阳明胃经，有部分主治功效相同，是否具有相同作用机制尚不明确，需要进一步深入研究阐明其具体机理。

综上所述，实验表明电针可以下调肝脏内质网应激信号分子p-PERK、p-IRE1α的表达，改善NAFLD 内质网应激，进一步抑制下游炎症因子TNF-α、IL-6的表达，减少炎症介质的释放，此外还可调节脂代谢紊乱，减少肝脏脂质沉积变性，且电针“丰隆”穴效果尤为显著。由此可推测，电针改善NAFLD的作用机制可能是通过调节内质网应激与炎症反应信号通路、改善ERS、减轻炎症损伤状态、改善脂质代谢、减轻肝脏脂肪变性而实现的。这可能为临床选择电针“丰隆”穴治疗非酒精性脂肪肝病提供理论依据。

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