树舌灵芝产漆酶发酵条件的优化

王书超　张宇　何爽

【摘 要】 本研究以树舌灵芝为试材，利用单因素试验分析碳源、氮源、温度及pH等因素对发酵产酶的影响，进一步采用Plackett-Burman设计对树舌灵芝发酵条件进行优化。结果表明在含20g/L玉米粉，5g/L豆粕的发酵产酶培养基（pH5.5）中，28℃条件下振荡培养7d，漆酶活性最高。

【关键词】 树舌灵芝；漆酶；发酵条件；优化

漆酶（Laccase）在环境治理、制浆造纸、生物监测、食品监测和绿色有机合成等领域也发挥着重要作用[1-2]。虽然漆酶在自然界中分布广泛，但真正具有较高漆酶产量的菌株并不多见[3]，且漆酶的发酵生产，国内目前尚未出现规模化，所生产的酶量还远远不能满足工业应用的需要，而主要依靠于进口，价格比较昂贵。因此，漆酶稳定高产菌株的选育十分必要[4]，同时对产酶条件的优化以及产酶调控机理的研究对于最终其规模化生产意义重大。本研究在前期实验确定树舌灵芝产漆酶的基础上，对该菌株发酵产漆酶培养条件进行优化，提高产酶效率，以便为产漆酶菌种的发酵生产及漆酶的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

菌种树舌灵芝（Ganoderma applanatum），由吉林农业科技学院生物工程学院分离并保存。

1.1.2 培养基

①PDA 培养基 ②发酵产酶培养基：马铃薯200g/L 、葡萄糖20g/L 、酵母膏5.0g/L、KH2PO4 3.0g/L 、MgSO4 1.5g/L 、ZnSO4 0.05g/L 、MnSO4 0 .05g/L。

1.2 试验方法

无菌条件下，将树舌灵芝菌株接种到PDA 培养基上，25 ℃避光培养 8 d。取活化好的菌丝块接种于100mL 液体发酵培养基中， 150 r/min 避光培养。抽滤分离发酵液，取滤液测定OD420nm吸光值。

分别以不同碳源（葡萄糖，蔗糖，淀粉，玉米粉，小麦麸皮）、氮源（蛋白胨，尿素，硫酸铵，硝酸铵，豆粕）代替基础培养基中的葡萄糖和硫酸铵进行发酵培养[6-7]，以ΔOD值为指标，分析不同碳源及氮源对树舌灵芝发酵产漆酶的影响；进一步考察不同温度（24℃，26℃，28℃，30℃，32℃）及pH（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）对发酵产酶的影响。

在单因素实验的基础上，设计正交试验对树舌灵芝发酵产漆酶条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同碳源对树舌漆酶活性的影响

如图1所示，在淀粉，玉米粉，葡萄糖以及蔗糖4种碳源中，玉米粉为最适合的碳源，其次分别为小麦麸皮、淀粉。

2.1.4 不同pH对树舌漆酶活性的影响

由图4所示，当pH5.0 时漆酶活性的最大，随着pH的升高，树舌漆酶活性逐渐降低。但当pH为6.5时，漆酶的活性又大幅回升。对于pH的影响不能简单认为是直接影响漆酶活性，也可能是因为改变了培养环境导致其他成分发生改变间接导致漆酶活性的变动。

由表2可知，最佳组合为A1B2C2D2，即培养基中碳源为玉米粉，氮源为豆粕，pH为5.5，发酵温度为28℃时酶活性最高。极差分析表明，对树舌产酶的影响，碳源>氮源>温度>pH。

3 结论

在前期平板实验初步验证树舌灵芝产漆酶活性较高的基础上，通过单因素实验与正交试验对树舌灵芝产漆酶培养条件进行了分析并优化，最终确定了适合树舌灵芝液体发酵产漆酶的最佳工艺条件。最适产酶培养基为马铃薯200g/L 、玉米粉20g/L 、豆粕5.0g/L、KH2PO4 3.0g/L 、MgSO4 1.5g/L 、ZnSO4 0.05g/L 、MnSO4 0 .05g/L（pH5.5），28℃條件下发酵7d漆酶活性最高。虽然本研究初步确定了树舌灵芝漆酶的发酵条件，但对于其应用于工业生产还有一段距离，目前研究小组正在对树舌灵芝进行诱变育种及下游漆酶的分离纯化工艺的研究，以期望不久的将来能将研究结果推广到大规模工业生产中，对未来漆酶的应用提供一定的参考。

参考文献：

[1] 姜竹茂， 缨静.漆酶的最新研究进展[J]. 烟台师范学院学报（自然科学版），2001： 123-28.

[2] 刘苹， 唐志红， 李梦玉， 等. 金针菇漆酶活性测定的最佳反应条件及液体培养胞外酶的研究[J].食品科技， 2012，（ 6） ： 14-17.

[3] 凡军民， 高大响， 刘进华， 等. 树舌灵芝深层发酵培养基的优化研究[J].食品与机械，2010.

[4] 潘志恒，岳鹍，孙勇民，等.树舌灵芝发酵产漆酶培养基优化[J] .保鲜与加工， 2016，16（4）：107-111.