组培柠檬桉叶绿素和挥发油研究

谷 瑶，周丽珠，李桂珍，韦颖文，杨 漓，温如斯

(1.广西壮族自治区林业科学研究院,广西南宁 530002;2.北京林业大学经济管理学院,北京 100083)

柠檬桉(EucalyptuscitriodoraHook)是桃金娘科(Myrtaceae)伞房属(Corymbia)树种，原产地澳大利亚，我国引种已有近百年历史，在我国海南、福建、广东、广西均有栽培，鲜叶含挥发油0.80%～2.12%[1]，主要成分有香茅醛、新异胡薄荷醇、异胡薄荷醇、香茅醇、乙酸香茅酯、对艹孟烷-3,8-二醇、β-石竹烯等[2]，广泛应用于日化、食品以及医药等行业[3-5]。

柠檬桉作为一种遗传相对稳定的树种，一直在广西推广种植。由于其枝叶内含物丰富，用其茎尖诱导产生丛生芽难以成功，无性系选育一直受扦插育苗、组培育苗成活率低(几乎等于零)的限制，广西渠黎林场成功地进行柠檬桉幼苗的嫁接，嫁接苗成活率提高到75%以上[6-7]。1994年广西壮族自治区林业科学研究院对柠檬桉茎尖进行组培繁育，茎尖诱导筛选出适合柠檬桉继代培养和生根培养的培养基[8]。目前针对柠檬桉组培苗移栽后生长情况的研究鲜见报道。笔者选取广西壮族自治区林业科学研究院组培柠檬桉(6年生)，测定柠檬桉生物量、叶绿素以及挥发油含量，旨在为柠檬桉油用林合理经营提供科学依据。

1 材料与方法

1.1试验地概况柠檬种植试验地位于广西壮族自治区林业科学研究院试验苗圃内( 108°21′E，22°56′N)，海拔90～100 m，该区域属亚热带季风气候，年平均气温约21.6 ℃，极端最高气温39.4 ℃，极端最低气温为12.8 ℃，雨量充沛，年平均降水量1 304.2 mm，平均相对湿度79%。

1.2仪器与药品超声波水浴锅(CS-24，常州朗博仪器制造有限公司)；UV-2550型紫外-可见分光光度计；TP3200电子天平；EGLL - 230B电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；不锈钢电热蒸馏水器(TT-98-Ⅲ，天津市泰斯特仪器有限公司)；TQ456气质联用仪(美国BRUKER公司)；Aglient 7890A气相色谱仪，弹性石英毛细管柱BR-5(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)。

丙酮、乙醇、甲醇(AR级，西陇化工股份有限公司)；95%乙醇(广东光华化学厂有限公司)。

1.3叶绿素提取随机抽采2017年8月广西壮族自治区林业科学研究院试验苗圃内6年生组培柠檬桉鲜叶，记录鲜叶总量，去除黄叶和枯叶，洗净后切成0.5 cm段，备用；丙酮、甲醇和乙醇均为AR级，蒸馏水自制。按体积比配制提取液(表1)。

表1 提取液配制

将一定量切碎处理后的柠檬桉鲜叶样品，放入试管中，在试管中分别加入10 mL 1#～11#提取液，密封试管口。然后将盛有样品的试管置于超声水浴锅中，在黑暗条件下超声一定时间后，当肉眼观察叶组织完全变白时，说明浸提完全，收集浸提液。叶绿素a和叶绿素b的最大吸收波长分别为663和645 nm，在663和645 nm波长下分别测定吸光度，以提取液做空白对照，将所得数据按公式(1)、(2)和(3)，分别计算柠檬桉鲜叶在不同浸提液下提取的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量(mg/g)。

叶绿素a=(12.7A663-2.69A645)×V/1 000×m

(1)

叶绿素b=(22.9A645-4.67A663)×V/1 000×m

(2)

总叶绿素=(8.02A663+20.21A645)×V/1 000×m

(3)

式中，A663和A645分别表示特定波长下叶绿素提取液的吸光度；V表示提取液的体积(mL)；m表示所用柠檬桉鲜叶组织鲜重(g)。

1.4柠檬桉挥发油提取与测定挥发油提取参考《中华人民共和国药典》2005年版第一部附录XD中挥发油测定法甲法中水蒸气蒸馏法[2]。采集柠檬桉组培苗，将柠檬桉鲜叶切成断，取一定量的叶装入2 000 mL圆底烧瓶，装上挥发油测定器和冷凝管，控制回流速度为1滴/s，蒸馏时间为2 h，收集油样。

采用气相色谱对柠檬桉叶油进行定量分析，并参照黎贵卿等[1]和田玉红等[2]气-质联用的定性分析数据以及GB/T 22179—2008，确定主要成分及含量。

2 结果与分析

2.1叶绿素采用不同提取液进行叶绿素提取，在分光光度计上扫描叶绿素浸提液的吸收光谱。结果表明，所得到的吸收光谱基本相似，长波长段的吸收峰也基本相似(图1)。说明所用提取液针对叶绿素溶解的化学性质基本相同，采用公式(1)、(2)、(3)计算叶绿素含量，结果见表2。

图1 柠檬桉鲜叶叶绿素在不同提取液中的吸收光谱Fig.1 The absorption spectra of chlorophyll of Eucalyptus citriodora in different extracts

提取液编号Extract solu-tionnumber柠檬桉叶质量The weight of Eucalyptus citriodora leaves∥gA645 nmA663 nm叶绿素aChlorophyll amg/g叶绿素bChlorophyll bmg/g总叶绿素Total chlorophyllmg/g10.2660.2150.5571.2220.4371.65920.2970.3080.8181.6110.5452.15630.2340.2150.5791.4480.4741.92340.2450.0770.2130.5100.1570.66750.3210.3440.9901.8150.5072.32370.3930.3040.8061.1990.4071.60660.2860.2830.8041.6500.4762.12680.2180.1560.4531.2220.3341.55590.2080.2180.6161.7400.5092.249100.2230.2310.6591.7410.4972.238110.2050.1920.5271.5100.4731.983

用不同提取液对柠檬桉鲜叶进行浸提，结果表明，不同提取液提取的叶绿素总量存在明显差异(表2)。丙酮、乙醇混合液以及丙酮、甲醇混合液提取的叶绿素含量较高，显著高于70%、80%、90%丙酮以及无水丙酮。丙酮∶乙醇=1∶1提取得到的柠檬桉叶绿素含量最高，为2.323 mg/g，叶绿素a/叶绿素b为3.580。

2.2挥发油由图2和表3可知，柠檬桉鲜叶挥发油鉴定出21种化合物，占挥发油含量的97.193%，其中含量最高的为香茅醛(76.873%)，其次是香茅醇(7.46%)，新异胡薄荷醇和异胡薄荷醇含量共为9.456%，乙酸香茅酯为1.106%。

不同月份柠檬桉鲜叶含油率以及挥发油含量见表4。由表4可知，试验地组培柠檬桉挥发油含量虽随着季节变化呈一定趋势，但总体差别不大，10月的柠檬桉含油率最高，香茅醛含量最高，该地区组培柠檬桉油用林最佳采收时间为10月，其挥发油特征组分含量符合国家标准要求，得到的油质较好，仅1月柠檬桉挥发油得率较低，柠檬桉得到的挥发油特征组分含量也符合国家标准。

图2 柠檬桉叶挥发油总离子图Fig.2 Total current chromatogram of Eucalyptus citriodora oil

3 结论与讨论

叶绿素是衡量植物生长状况的重要指标之一。采用不同浸提液对组培柠檬桉鲜叶进行浸提，叶绿素测定结果整体存在显著差异。从试验结果看，丙酮、乙醇混合浸提液对柠檬桉鲜叶叶绿素提取效果最佳。

挥发油含量是衡量柠檬桉油用林品质的首要标准。通过不同月份采集柠檬桉鲜叶提取挥发油试验，结果发现，组培柠檬桉得油率不高，且随季节变化不显著，仅1月份柠檬桉得油率最低，但挥发油特征组分均符合柠檬桉(精)油国标要求。建议避开1月采叶蒸馏。

表3 柠檬桉叶挥发油成分

表4 不同月份柠檬桉鲜叶挥发油含量

[1] 黎贵卿,陆顺忠,曾辉,等.柠檬桉枝叶挥发性成分的研究[J].广西林业科学,2012,41(4):352-355.

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