油茶籽饼粕多糖的分离纯化及结构分析

徐迪

(芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽 芜湖 241000)

徐冰彦

(合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

金日生

合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009;中国林业科学研究院林产化学工业研究所，江苏 南京 210042

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)为山茶科山茶属小乔木[1]，是中国特有木本原料，分布较广[2]。其种子可榨茶油供食用，油茶籽饼粕是榨油副产物[3]，主要含有茶多糖20%～40%[4]。油茶籽饼粕多糖具有降血糖等多方面的生物活性作用[5～7]。本研究从油茶籽饼粕中分离纯化其多糖并进行结构分析，以期为油茶籽饼粕开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

油茶籽饼粕粗多糖：自制；DEAE-52：沃特曼公司；牛血清白蛋白BSA：青岛仁和兴公司；考马斯亮蓝：国药试剂公司；其余试剂均为分析纯，国药试剂公司。

十万分之一天平：SARTORIUS公司；ELGA超纯水机：Veolia Water Syestem公司；BT-200恒流泵：上海琪特分析仪器公司；透析袋 MWCO 3.5 kDa：北京索莱宝公司；752N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器公司；Nicolet-6700傅立叶变换红外光谱仪：美国热电公司；Agilent1200高效液相色谱仪：安捷伦公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法，以牛血清血蛋白为对照测定。精密量取上述1mg/mL对照品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL分别置于10mL试管中，依次添加0.15mol/L NaCl溶液，使终体积为1.0mL，空白对照为0.15mol/L NaCl溶液1.0mL，分别加5mL考马斯亮蓝染色液，震荡摇匀，室温下放置10min，紫外595nm处测定光密度，以对照品浓度为横坐标，光密度为纵坐标，制作标准曲线。

取多糖样品10mg，精密称定，加蒸馏水定容至50mL，吸取1mL至10mL试管中，测定光密度值，计算多糖中的蛋白质含量。

1.2.2 油茶籽饼粕多糖的纯化

1) 脱蛋白 多糖样品溶水溶液加入氯仿-正丁醇(4∶1)，倒入分液漏斗，再加入sevage试剂以5∶1的比例混合，振荡15min，6000r/min离心10min，收集上层水相，重复5次。

2) 脱色纯化 脱蛋白后的多糖溶液缓慢加入等量10%的双氧水，30℃水浴48h后，即得脱色后样品。将200mg多糖样品溶于1mL水中,DEAE-52纤维素柱层析，水洗脱后，再用0～1.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集洗脱液，流动水透析48h，冷冻干燥，即得。

1.2.3 紫外分析

取50mg多糖，精密称定，定容至10mL，紫外200～400nm范围内测定。观察在260nm和280nm处有无吸收峰判断是否含有蛋白质及核酸。

1.2.4 红外分析

多糖样品溴化钾压片，在500～4000cm-1处进行红外测定[8]。

1.2.5 相对分子量的测定

参考文献[9]，采用HPLC法测定。由葡聚糖凝胶柱Ultrahydrogel TM2000(7.8×300mm Column)和Ultrahydrogel TM500(6×40mm Guard Column)串联，ELSD检测器；流动相为超纯水；流速：0.5mL/min；漂移管：90℃；柱温：35℃；增益：100；气体压力：25psi(1psi=6.895kPa)；上样量：20μL；根据保留时间及线性方程计算相对分子量。

1.2.6 单糖组成分析

精确称取5mg样品乙酰化后气相分析。不同单糖对照品对照。气相条件：石英毛细管柱HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)；柱温50→250℃(升温速度：10℃/min)；离子源：EI，70eV；进样口温度260℃；相对分子质量范围：35～650；He流速：1mL/min。

2 结果与分析

2.1 多糖中的蛋白质含量

根据蛋白质标准曲线Y=3.351X+0.2627 (R=0.9992)可计算出多糖中蛋白质含量为11.7%，纯化后含量降低到1.1%。蛋白质脱除率为90.6%。

2.2 脱色纯化

由图1可知，脱色及DEAE-52纤维素柱层析纯化可得到多糖组分，即为0.4mol/L NaCl溶液洗脱的组分。

图1 纤维素DEAE-52柱层析图

2.3 紫外分析

由图2可知，紫外光谱分析表明样品在260nm和280nm处均无吸收峰，确定纯化后多糖中均不含有蛋白质和核酸。

2.4 红外分析

由红外光谱(图3)可知3388cm-1吸收峰是糖羟基氢键伸缩振动显示的宽峰；2920cm-1吸收峰为C-H伸缩振动峰，表明可能存在甲基和亚甲基；1650cm-1处的强吸收带为羰基的不对称伸缩振动，1420cm-1处的吸收峰为变形的C-H键的振动，表明该组分为多聚糖；1100～1010cm-1仅有2个峰，则可判断该糖组分含有呋喃糖苷。

2.5 相对分子量

经HPLC检测，0.4mol/L NaCl溶液洗脱液为单一对称峰，保留时间为14.221min，根据保留时间及线性方程计算出该多糖的分子质量为2.0121×107u。HPLC色谱见图4。

图2 油茶籽饼粕多糖紫外扫描图谱图3 油茶籽饼粕多糖的红外光谱图

图4 油茶籽饼粕多糖高效液相凝胶渗透色谱

2.6 单糖组成分析

GCGC分析表明多糖其主要由鼠李糖、木糖和葡萄糖组成，且摩尔比为11.19∶17.06∶5.81。主要组成为鼠李糖和木糖。结果见图5、6。

图5 标准单糖的GC图谱图6 油茶籽饼粕多糖水解产物的GC图谱

3 讨论

本研究从油茶籽饼粕中提纯多糖，并对其结构进行分析。通过脱蛋白、脱色、DEAE柱色谱纯化、0.4mol/L NaCl洗得多糖，采用高效液相色谱及乙酰化气相分析。其分子质量约为2.0121×107 u。IR可见多糖特征吸收峰，UV表明不含蛋白质和核酸。主要组成有鼠李糖、木糖和葡萄糖构成，摩尔比为11.19∶17.06∶5.81。此研究可为油茶籽饼粕的开发利用提供依据。