构树修复对重金属污染土壤环境质量的影响

曾 鹏,郭朝晖,肖细元,彭 驰,黄 博,辛立庆 (中南大学,冶金与环境学院环境工程研究所,湖南 长沙 410083)

植物修复具有环境友好、成本低、美化环境、不易引起二次污染等优点而被广泛利用[1].目前植物修复重金属污染土壤的研究主要集中在东南景天(Sedum alfredii H.)[2]、龙葵(Solanum nigrum L.)[3]等超富集植物和海桐(Pittosporum tobira)[4]、珊瑚树(Viburnum odoratissinum)[5]、泡桐(Paulownia fortunei)[6]、柳树(Salix)[7]等耐性植物.木本植物具有生物量大,生长周期长,较大的绿色空间和发达的根系,可广泛用于重金属污染土壤的生态复垦[8].然而利用植物修复污染土壤的最终目标不仅是清除或减少土壤中的重金属等污染物,而且要求恢复污染土壤的生物学特性.有研究表明,重金属对土壤酶和微生物活性的抑制作用明显[9-11].但植物可有效降低污染土壤中重金属对土壤酶活性和微生物的不利影响[12].耐性植物白玉草(Silene vulgaris)可恢复重金属污染土壤的β-半乳糖苷酶活性,在根际细菌群落中出现了新的物种[13].种植玉米(Zea mays L.)有利于降低 Cd和Pb对土壤脲酶和脱氢酶的抑制作用,并提高土壤基因多态性和基因丰富度[14].因此,植物在修复和改善重金属污染土壤生态环境质量上扮演重要的角色.

构树(Broussonetia papyrifera)属于桑科构属的落叶乔木,具有速生、适应性强、分布广、易繁殖等特点,适于重金属污染矿区生长,是矿区植被恢复的先锋树种[15].有研究表明,每株构树一年可移除Zn和Cu的总量可达 32.5和 6.67mg[16],且构树对多种重金属都有较强的富集与转移能力,其综合生物浓缩指数可达 2.93[17].总之,构树在修复重金属污染土壤方面具有巨大应用前景.然而构树在修复重金属污染土壤过程中对污染土壤环境质量的影响还不是很清楚.因此,本文通过温室盆栽试验,研究构树在修复重金属污染土壤过程中对土壤酶活性和微生物群落结构的影响,以期为构树大规模生态修复重金属污染土壤提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试土壤和植物

温室盆栽土壤采自湖南省某典型冶炼区0～20cm的表层土壤,土壤基本理化性质如表1所示.收集的土壤风干过 5mm 筛后用于盆栽试验.供试植物构树苗采自野外生长的构树幼苗.

表1 供试土壤基本理化性质Table 1 Basic physiochemical properties of tested soil

1.2 实验设计

将过5mm筛的土壤混合均匀后装入长33cm,宽22cm,高 19cm 的塑料盆中.每盆装入土壤 10kg.每盆加入2.7g CO(NH2)2,0.5g NH4H2PO4,1.6g KNO3作为基肥.基肥以70%的田间持水量加入土壤中,平衡30d后,统一移栽大小一致的构树幼苗.每盆 3次重复.试验期间,光照周期为10h/d,温室内昼夜温度为30/20,℃根据盆栽土壤水分状况浇灌去离子水,以保持盆栽土壤湿润.构树修复和未修复(对照)的土壤在60,90,150,210和270d后进行动态取样.采取5点取样法取出适量土壤,一部分用于土壤重金属有效态含量测定,一部分用于土壤酶活性测定和土壤 DNA的提取.分别动态收获修复90,150,210和270d后的构树植株.将每次收获的构树植株按根、茎、叶分开,依次用自来水和去离子水清洗干净后,105℃杀青30min后,在60℃下烘干至恒重,称重,粉碎备用.

1.3 测试与分析

土壤基本性质的分析根据鲁如坤[18]的方法:土壤pH值采用Mettler Toledo 420 pH计测定(水土比为2.5:1);土壤有机质含量采用低温外热重铬酸钾氧化-比色法测定;土壤碱解氮、有效磷和速效钾分别采用碱解扩散-硫酸滴定法、碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法和乙酸铵提取-原子吸收法测定.植物样品采用HNO3-HClO4(5:1)消解,土壤样品采用HNO3-HClO4-HF(5:4:1)消解,土壤中有效态Cd,Pb,Zn和Cu含量采用DTPA浸提(GB/T 23739-2009)[19],土壤有效态As含量采用0.5mol/L NaHCO3浸提[20],消解液和浸提液中Cd,Pb,Zn和Cu含量采用ICP-OES(等离子发射光谱仪,Thermo)测定,As含量采用双道原子荧光光度计(AFS-2202E,北京海光仪器公司)测定.

土壤酶活性参照关松荫[21]的方法测定:土壤脱氢酶活性测定采用红四氮唑(TTC)比色法,脱氢酶活性单位为37℃下,24h内土壤中三苯基甲臜(TPF) µg/g;土壤脲酶活性测定采用靛酚蓝比色法测定,脲酶活性单位为37℃下,24h内土壤内NH4+-N µg/g;土壤蔗糖酶采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定,以37℃下培养24h内土壤中葡萄糖(glucose)mg/g;土壤酸性磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法,酸性磷酸酶活性单位为37℃下,3h内土壤内中酚(phenol)µg/g.

土壤DNA提取以及PCR-DGGE分析:土壤DNA提取根据土壤DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek,US)说明书操作,-20℃保存.土壤DNA 16S和18S rDNA PCR扩增程序分别参见Xiao等[22]和Xu等[23]的方法.然后取16S或18S PCR扩增产物15µL,在聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%(100%的变性剂为7mol/L尿素和40%的去离子甲酰胺),变性剂梯度范围 45%～70%(细菌)或30%～50%(丛枝菌根真菌),60℃下55V电泳14h(细菌)或 12h(丛枝菌根真菌).电泳结束后,采用 EB染色法(0.5µg/L)对凝胶染色 10min,然后用 Gel DOCTMXR+凝胶成像系统进行成像(Bio rad,USA).

1.4 数据分析

所有试验数据采用Microsoft Excel 2016进行分析处理.采用SPSS 16.0统计软件进行显著性检验和相关性分析.

构树体内重金属富集总量的计算根据如下公式:

式中:T地上部分、T地下部分和 T总和分别表示构树地上部分、地下部分和整株对某种重金属的富集总量,mg;C叶、C茎和C根分别表示构树叶片、茎和根部的某种重金属含量,mg/kg;B叶、B茎和B根分别表示构树叶片、茎和根的干重,g.

DGGE图谱由Quantity One (version 4.6.2)进行分析.香农-维纳指数(H)的度算根据式(4):

式中:ni为每个条带的峰面积,N为所有条带的总峰面积.均匀度指数(E)的计算公式为:

式中:S为每个泳道的条带数.采用CANOCO 5.0分析土壤环境因子与微生物群落之间的联系.

2 结果与讨论

2.1 构树对污染土壤中重金属的富集特征

构树对污染土壤中重金属的富集总量见图 1.构树体内As和Pb的富集总量随修复时间的延长无明显变化,Cu的富集总量随修复时间的延长呈现下降的趋势,原因可能与植物根系长时间与土壤重金属直接接触,植物采取一定的保护措施来降低污染土壤中重金属对植物的毒害有关[24],进而限制植物对污染土壤中As,Pb和Cu的富集.然而构树对Cd和Zn富集总量随着修复时间呈现显著增加的趋势,且构树体内对Cd和Zn的最大富集总量为2.26,66.8mg/pot,同时,在修复270d后,地上部分Cd和Zn的富集总量与地下部分相当,分别可达1.17和38.2mg/pot.童方平等[15]研究表明锑矿区重金属污染地4a生构树整株可富集1.99mg Cd和67.33mg Zn,与本研究结果相似.但赖发英等[16]表明每株一年生构树对污染土壤中Zn和Cu移除总量分别为32.51和6.67mg.本研究中构树对Cu的富集总量一般,原因可能与本研究污染土壤中存在多种重金属离子,进而导致植物对污染土壤中重金属离子的选择性吸收有关[25].研究表明,构树可有效富集污染土壤中的Cd和Zn,可用于Cd和Zn污染土壤修复与治理.

图1 构树对污染土壤中重金属的富集量随时间的变化趋势Fig.1 The total accumulation of heavy metals in B. papyrifera along with cultivation

2.2 构树生长对污染土壤酶活性的影响

构树修复重金属污染土壤过程中土壤脱氢酶、脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性随着修复时间的变化见图2.构树修复下,脱氢酶在4种酶活性中对复合污染土壤最为敏感,并随着修复时间的延长呈显著下降并趋于平衡,与郭朝晖等[9]和 Liu等[26]的研究表明污染土壤中脱氢酶对重金属比较敏感,并且植物修复难以恢复其正常酶活性,与本研究结果一致.整个修复期间,与无植物修复的土壤相比,构树修复下土壤脲酶活性无明显变化;蔗糖酶活性和酸性磷酸酶活性在修复 90d时达到最大值 6.09mg glucose/(g·d)和192.4µg phenol/(g·3h),脲酶活性在修复 150d 时达到最大值 76.5µg NH4+-N/(g·d),随后随时间显著下降,原因可能与污染土壤中重金属对土壤酶活性具有一定程度的抑制作用有关[27].然而,构树修复270d后,土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶活性显著(P＜0.05)提高 3.12倍和 2.29倍.这可能是随着修复时间的延长,植物根系的生长在一定程度上可缓解重金属对土壤酶活性的抑制作用.植物修复过程中根系分泌各种有机酸、生长激素等活性物质[28],有利于污染土壤中微生物的生长和活性的提高,从而直接或间接的改善土壤酶活性,与高扬等[14]研究种植玉米可减轻Cd和Pb对土壤磷酸酶和脲酶的影响的结果一致.因此,构树修复有利于减弱土壤重金属对土壤酶活性的毒害作用,维持土壤脲酶的正常活性并改善土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶活性,促进污染土壤生物学特性的恢复.

图2 构树修复过程中土壤酶活性随时间的变化趋势Fig.2 Change of soil enzyme activities along with cultivation under B. papyrifera remediation

2.3 构树修复下污染土壤中重金属有效态含量与酶活性的相关性分析

构树生长下土壤中有效态 As,Cd,Pb,Zn和 Cu含量随着修复时间呈增加趋势(表 2).在修复初期(0～150d),土壤中重金属有效态含量均无显著变化.修复270d后,土壤中有效态As,Cd,Pb,Zn和Cu含量与未修复的土壤(0d)相比分别提高 56.1%,9.21%,14.2%,19.0%和11.9%.同时土壤pH值随修复时间呈下降趋势,且与土壤有效态Cd,Pb,Zn和Cu含量呈负相关,其中与Zn和Cu呈显著(P＜ 0.05)负相关(表3).由于构树根系活动旺盛,可分泌大量根际分泌物如草酸、苹果酸、柠檬酸和富里酸等,可一定程度降低土壤 pH值,使土壤中重金属有效态含量显著提高[29].然而,污染土壤中As,Cd,Pb,Zn和Cu有效态含量分别占总量的 0.87%～1.61%,55.34%～64.32%,34.93%～39.98%,24.69%～31.99%和25.15%～32.37%,其中土壤中 Cd,Pb,Zn和 Cu活性和含量都较高,植物修复无法在短时间内有效提取和富集,因此必须辅助物理和化学措施来强化构树修复重金属污染土壤.

表2 构树修复下污染土壤中pH值和重金属有效态含量的变化Table 2 Changes of pH and heavy metals available contents in contaminated soil with B. papyrifera remediation

从表3可看出,构树修复下污染土壤中重金属有效 态含量与脱氢酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性呈负相关,其中土壤脱氢酶与有效态As,Cd,Pb,Zn和Cu含量,蔗糖酶与有效态Cd含量,以及磷酸酶与有效态Cd和Cu含量分别呈显著负相关(P＜0.05),与Zeng等[30]得出的在植物修复下土壤中有效态 Cd与土壤脱氢酶和脲酶呈显著负相关的研究结果类似.重金属对污染土壤酶活性的抑制主要表现为:①对土壤微生物的毒害效应;②与土壤酶的活性基团结合;③与酶的底物基质发生络合反应;④对酶底物的竞争性抑制[31].然而植物生长过程中,污染土壤中重金属离子对植物根系的刺激作用可促进植物分泌大量的活性物质和一些胞外酶等[28-29],同时植物的生长也为根际微生物提供有利的生存空间,因此在植物和微生物共同作用下有效的改变根-土界面的生物化学环境,从而在一定程度的改善土壤酶活性[28,32],与Cui等[33]得出的海州香薷可改善Cd和Cu污染土壤的脲酶、过氧化氢酶和酸性磷酸酶活性的研究结果一致.

表3 构树修复下土壤pH值,酶活性和重金属有效态含量的相关性分析Table 3 Relationship of soil pH, enzyme activities with the content of available heavy metals in soil

2.4 构树修复下土壤微生物群落结构的变化

重金属污染后土壤微生物数量和微生物的群落结构可能发生显著的变化[10,34].在构树修复重金属污染土壤过程中,土壤微生物群落变化的DGGE图谱见图3.基于DGGE图片每个条带的强度,主要的细菌条带随着修复时间的延长无明显变化,但部分细菌条带变弱或加强,这与Wu等[35]得出的在植物修复Ni污染土壤过程中主要细菌存在于整个修复周期并与植物形成特殊的群落结构的研究结果一致.而构树修复的不同期间,土壤中丛枝菌根真菌群落结构具有较大差异,原因可能与植物生长期、温度、土壤重金属的活性和其他环境因子有关.构树修复下土壤细菌随修复时间的延长无明显变化,而丛枝菌根真菌群落变化明显,与Jia等[36]得出的在Cu污染土壤植物恢复过程中,不同修复时间下土壤中主要真菌群落及其组成具有较大的变化,而细菌群落的结构和相对丰度无明显变化的研究结果一致.因此,构树修复重金属污染土壤中微生物的适应与演替在污染土壤的生态修复与重建过程中扮演重要的作用.

多样性和均匀度指数被用来衡量一个生态环境中物种的多样性和均匀性.构树修复下土壤中细菌和丛枝菌根真菌的香浓-威纳多样性和均匀度指数见表 4.与未修复的土壤(0d)相比,构树修复下(60～270d)土壤细菌和丛枝菌根真菌的均匀度指数无显著差异,但其香农-威纳多样性指数得到提高,尤其是细菌多样性指数显著提高(P＜0.05),原因可能是植物在生长过程中,可向根际土壤中释放多种多样的根系分泌物或植物根际碎片裂解物,这些化合物支撑着不同营养需求的微生物生长与繁殖[28].在构树修复的整个周期(60～270d),细菌和丛枝菌根真菌的香浓-威纳多样性指数均比较稳定,这可能与土壤中微生物群落在长期重金属污染的环境下对重金属产生了抗性、耐性或适应性有关[37].因此,构树能有效改善重金属污染土壤的微生物活性并维持土壤微生物多样性的稳定.

图3 构树修复下土壤细菌和丛枝菌根真菌的DGGE图谱Fig.3 DGGE profiles of bacteria and arbuscular mycorrhizal (AM) fungi in contaminated soil with B. papyrifera remediation

表4 构树修复下土壤微生物多样性和均匀度指数Table 4 Microbial diversity and evenness index in soil remediated with B. papyrifera

将细菌和丛枝菌根真菌的DGGE图谱数字化后,分别与环境因子结合进行冗余分析(RDA),结果如图4所示.RDA分析的轴1和轴2之和对土壤细菌和丛枝菌根真菌群落的解释量分别为 69.42%和 61.29%,说明 RDA排序分析能较好的反应土壤微生物(细菌和丛枝菌根真菌)与环境因子之间的关系.从图4可看出,污染土壤中重金属有效态含量对细菌和丛枝菌根真菌群落具有较强影响,尤其是有效态Cd,Zn和Cu对土壤中细菌和丛枝菌根真菌群落的影响较大,与大多数研究表明污染土壤中重金属可改变土壤微生物的活性和组成的研究结果一致[10-11].而且土壤中脱氢酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性与重金属有效态含量均呈负相关,进一步表明土壤中重金属有效态含量对土壤酶活性的不利影响,与表3结果一致.从图4可进一步看出,土壤pH值与脱氢酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性具有较强的相关性,土壤 pH值的变化主要来源于构树修复重金属污染土壤过程中根系分泌物(如柠檬酸、苹果酸、富里酸等),进而改善污染土壤酶活性,与Hou等[38]得出的东南景天可降低土壤pH值,提高土壤重金属生物有效性,同时增加根际微生物的活性的研究结果一致.因此,构树有利于提高重金属污染土壤的酶活性,同时提高土壤中微生物的活性,促进共代谢作用,进而有助于污染土壤的生态恢复与重建.

图4 细菌和丛枝菌根真菌群落与环境因子的RDA排序图Fig.4 RDA ordination diagram of bacteria and AM fungi communities associated with environmental factors

3 结论

3.1 盆栽试验结果表明,构树可有效吸收污染土壤中Cd和Zn.经270d培养后,构树地上部分Cd和Zn富集总量分别达1.17和38.2mg/pot.

3.2 构树修复可有效提高污染土壤酶活性和微生物多样性.经 270d培养后,构树修复污染土壤中蔗糖酶和酸性磷酸酶活性与未修复土壤相比显著(P＜0.05)提高3.12倍和2.29倍.通过16S和18S rDNA PCRDGGE分析表明,构树修复可提高污染土壤中细菌和丛枝菌根真菌的多样性,并维持污染土壤中微生物群落的稳定.

3.3 构树修复可有效改善重金属污染土壤的酶活性和微生物群落结构等生物学特性,然而土壤重金属有效态含量下降不明显,必须辅助物理和化学措施来强化构树对重金属污染土壤的生态修复效果.