响应土壤阴离子类型的盐碱土古细菌群落多样性研究

俞冰倩,杨 赛,朱 琳,高 凤,曾椿淋,柳参奎,崔恒林,魏 巍* (.江苏大学农业装备工程学院,江苏 镇江0；.江苏大学食品与生物工程学院,江苏 镇江 0；.东北林业大学,盐碱地生物资源环境研究中心,黑龙江 哈尔滨50040)

盐碱土是陆地上分布广泛的一种土壤类型.我国盐碱土面积大,类型多样,主要分布在我国华北、东北和西北的内陆干旱、半干旱地区,以及东部沿海的滨海地区,是我国重要的后备耕地资源[1].根据盐碱土中土壤阴离子的不同(如HCO3-、CO32-、SO42、Cl-等),我国主要分布的盐碱土类型包括富含氯化物的滨海盐碱地、含有氯化物和硫酸盐的华北泛滥平原盐碱地、富含硫酸盐(2～10倍于氯化物)的西北内陆荒漠盐碱地,以及富含碳酸根/重碳酸根的东北草原盐碱地等[2].这些不同类型的盐碱地土壤多为极端的高盐高碱环境,虽不适宜动、植物的生存,但却栖息着大量的耐盐碱、甚至嗜盐碱的微生物类群[3].这些微生物的生命活动在改变盐碱地土壤理化性质的同时,也受到其极端理化性质的影响,从而可能形成适应高盐碱环境的,与一般微生物不同的细胞结构、遗传特性和生理功能[4].而上述可用来划分盐碱土类型的土壤阴离子的含量和种类,很可能是影响土壤微生物群落分布的重要环境因子.因此,我国分布的具有不同阴离子类型的盐碱土是潜在的天然微生物资源宝库.

古细菌是一类区别于细菌的原核微生物,其独特的基因类型和生理特点使其具有适应、甚至改变高盐高碱环境的能力[5].同时其代谢产物多具有开发利用的潜力.例如嗜盐古菌产生的生物多聚物胞外多糖(EPS)能够应用在食品、药品等众多行业[6];嗜盐古菌产生的胞外蛋白酶可应用于高盐发酵工业、洗涤和污水处理等[7].因此,对我国不同地区分布的不同阴离子类型的盐碱土进行古细菌群落多样性的研究,既可以为揭示不同盐碱土生态效应提供重要依据,也可以为耐盐或嗜盐古细菌资源的开发提供重要参考.然而,目前研究土壤古细菌群落的培养法和免培养法均具有一定的局限性[8].培养法的工作量大耗时长,以及受到培养基和培养条件的限制,无法获得土壤中微生物的种群结构[9].PLFA[10]、PCR- DGGE[11]和 16S rRNA克隆文库[12]等免培养方法仍难以确定微生物群落全貌,无法全面地揭示微生物群落的多样性[13].而新一代基于 Illumina平台的高通量测序技术的出现,可以更全面、更准确地解析环境中微生物群落多样性的特征,为解析我国不同地区分布的不同阴离子类型的盐碱土土壤中古细菌群落多样性提供了有力手段[14].

近几年,我国盐碱土微生物群落特征的解析研究逐渐受到人们的关注[15,29,41].如李新等[16]基于高通量测序研究了内蒙古河套灌区3种不同盐碱程度盐碱土的细菌群落,结果表明变形菌门(Proteobacteria)是主要的细菌类群.李海云等[17]研究了原生盐碱土、次生盐碱土和农田土中的放线菌群落结构特征,研究结果展现了盐碱土壤中蕴藏着丰富的放线菌资源,原生盐碱土的放线菌种群丰富度最高,次生盐碱土次之,农田土最低.但对于古细菌群落结构特征的解析研究尚未广泛开展,因此我国不同地域盐碱土壤古细菌群落分布尚不明确.而上述划分我国不同地域盐碱土类型的不同土壤阴离子种类和浓度,很可能成为盐碱土微生物群落演替的关键因素.因此,本研究通过采集我国黑龙江安达苏打盐碱土(东北草原盐碱地)、新疆达坂城盐碱土(内陆荒漠盐碱地)、山西运城盐碱土(华北平原盐碱地)、江苏东台海滨盐碱土(滨海盐碱地)和天津滨海新区盐碱土(滨海盐碱地)等 5个分布于不同地域和气候条件的盐碱土土壤,基于高通量测序技术对其古细菌群落多样性进行了深度解析,并通过与盐碱土壤阴离子类型和含量特征的关联分析,明确盐碱土土壤阴离子对土壤古细菌群落特征形成的影响,为进一步揭示我国不同类型盐碱土壤古细菌群落的生态功能提供参考.同时,为我国不同类型盐碱土壤微生物资源的开发利用提供指导.

1 材料与方法

1.1 盐碱土壤样品的采集

采样地位于我国黑龙江安达苏打盐碱地(HA)、新疆达坂城荒漠盐碱地(XD)、山西运城平原盐碱地(SY)、江苏东台滨海盐碱地(JD)和天津滨海盐碱地(TB).采样时间为2015年5月.采用五点取样法,在各采样地区选取无植被覆盖的裸露盐碱土(避免植物根系分泌物对古细菌群落的影响),用土钻取土壤表层0～20cm 的土样,然后将五个样点采集的土样均匀混合.采集好的土壤置于冰盒中,尽快发送回实验室.将土壤分成 2份,-80℃条件下保存一份供分子生物学研究,一部分土样风干过筛后用于不同理化指标的测定.

1.2 土壤理化性质的测定

对五个不同类型盐碱土样进行 pH以及重碳酸根离子(HCO3-)、碳酸根离子(CO32-)、氯离子(Cl-)和硫酸根离子(SO42-)四种阴离子含量的测定.称取10.0g风干过2mm筛的土壤,置于50mL烧杯中,加入25mL水,密封后振荡5min,静置2h,用梅特勒-托利多公司的FE28pH计测定pH值.土壤中和的含量采用双指示剂–中和滴定法[18]. Cl-和 SO42-的含量采用离子色谱法测定.仪器为瑞士万通 883basic IC plus离子色谱仪,淋洗液是碳酸钠体系.称取氯化钠1.649g,硫酸钠1.478g溶于小烧杯中,转移至1L容量瓶中,定容至刻度,摇匀,配成浓度均为1000mg/L的混合标准溶液,将其稀释成不同浓度进行标准曲线的制作[19].称取风干土样 2.5g(精确到 0.001g)于 50mL离心管中,加入 25mL超纯水,塞紧瓶塞,在 25℃恒温振荡器上振荡16h,在4000r/min下离心15min,取上清液,用 0.22µm 的滤膜过滤,将样品稀释成适当的浓度进行检测.

1.3 样品的DNA提取

分别从充分混合的样品中取0.5g土壤提取微生物基因组DNA.应用日本和光公司的DNA提取试剂盒Isoil beads beating,按照操作说明进行微生物基因组总DNA的提取.提取后的总DNA应用Nanodrop one进行浓度的测定.

1.4 PCR扩增及高通量测序

本试验采用古细菌16SrRNA的V4区域作为目标DNA序列进行PCR扩增.PCR扩增以古细菌16S rRNA的 V4可变区设计的古细菌通用引物NU519F(GTGYCAGCMGCCGCGGTAA)和N806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT),并各自添加不同的Barcode序列后对5个不同类型盐碱土样中古细菌16S rRNA的 V4区域进行扩增.PCR扩增均采用Takara试剂公司的 HS Taq酶进行,反映条件均为95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸 40s,25个循环; 72℃延伸 10min[20].扩增结束后,PCR扩增产物使用 1%琼脂糖进行凝胶电泳,检查扩增效果.将PCR产物送至北京诺禾致源科技有限公司Illumina-Hiseq平台上进行高通量测序.

1.5 数据分析处理

5个样品高通量测序获得的原始DNA序列数量在51927-69762之间(表2).对原始序列数据进行质量控制,以获得更为精准、高质量的 DNA序列信息.采用Mothur软件将得到的16S rRNA基因序列在Silvar数据库中进行嵌合体检验,充分去除嵌合体序列.为了得到每个 OTU对应的物种分类信息,采用贝叶斯算法对 97%相似水平的操作分类单元(OTU)代表序列进行分类学分析,并在各个水平上统计每个样品的群落组成,利用 Mothur软件构建稀释性曲线[21-22].用QIME软件计算样品 Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数[23-24].其中Chao1指数描述群落丰富度,其值越高表明群落物种的丰富度越高;Shannon指数和Simpson指数可以反映样品的多样性程度,其值越大表明样品群落多样性越高.

2 结果与分析

2.1 不同盐碱土样品理化性质分析

盐碱土样品的理化性质如表1所示.5个土壤样品的pH值为7.6～9.5,pH值由高到低依次为黑龙江苏打盐碱土(HA)、山西平原盐碱土(SY)、天津滨海盐碱土(TB)、新疆荒漠盐碱土(XD)、江苏滨海盐碱土(JD).HCO3-主要存在于黑龙江苏打盐碱土(HA)中,含量为 4.66cmol/kg,在其他土样中含量均很少.CO32-只存在于黑龙江苏打盐碱土(HA)中,含量为 2.87cmol/kg.5个土样中均含有Cl-(含量为0.2～89.8cmol/kg)和SO42-(含量为0.1～62.2cmol/kg),且不同样品间均有很大差异.江苏滨海盐碱土(JD)和天津滨海盐碱土(TB)样品具有较高的 Cl-浓度,新疆荒漠盐碱土(XD)样品中具有最高的 SO42-浓度,黑龙江苏打盐碱土(HA)样品中 Cl-和 SO42-的含量均为最低,山西平原盐碱土(SY)样品中同时具有较高的Cl-和 SO42-浓度,且浓度值较为相近.由此可见,不同地域的盐碱土具有不同的pH值及土壤阴离子特征.

表1 五种盐碱土壤样品的理化性质Table 1 Physicochemical properties of five kinds of saline-alkali soil samples

2.2 不同盐碱土壤古细菌群落丰富度与多样性

通过对黑龙江苏打盐碱土(HA)、新疆荒漠盐碱土(XD)、山西平原盐碱土(SY)、江苏滨海盐碱土(JD)、天津滨海盐碱土(TB)五种不同类型盐碱土壤古细菌 16S rRNA序列片段测序.得到的原始序列经去除低质量、Barcode和引物序列后,5个样品分别得到 59,740、62,073、47,950、52,282、46,494条有效序列,经过 RDP数据库的注释以及 OTU分析后,分别获得 580、604、516、489、536个古细菌OTU(表2).所有土壤样品中古细菌16S rRNA测序文库覆盖率均超过99.5%(表2),说明更深的测序几乎不会产生更多的OTU种类,该五个土壤的测序文库已经达到饱和.根据古细菌 16S rRNA测序的稀释性曲线(图1A),当测序量超过40000条时,整个曲线已经趋于平缓,同样说明该测序文库已经达到饱和.

表2 五种盐碱土壤古细菌群落高通量测序文库质量汇总Table 2 Information of high-throughput DNA sequencing library of five kinds of saline-alkali soil samples

图1 五种盐碱土壤古细菌群落高通量测序文库稀释曲线(A)及OTU维恩图(B)Fig.1 Rarefaction curve of high-throughput DNA Sequencing library(A) and Venn diagram of archaeal community (B)in five kinds of saline-alkali soils

从表2中可以看出,新疆荒漠盐碱土(XD)和黑龙江苏打盐碱土(HA)的古细菌群落OTU数量和Chao1指数均高于其他土壤样品,说明新疆荒漠盐碱土(XD)和黑龙江苏打盐碱土(HA)中土壤古细菌群落具有最高的丰富度,即新疆荒漠盐碱土(XD)和黑龙江苏打盐碱土(HA)中古细菌物种数量高于其他土壤样品.通过比较五种盐碱土壤古细菌群落的 Simpson指数和Shannon指数可以发现,黑龙江苏打盐碱土(HA)和新疆荒漠盐碱土(XD)的Simpson指数和Shannon指数是五个土壤样品中最低的,黑龙江苏打盐碱土(HA)和新疆荒漠盐碱土(XD)的古细菌群落多样性低且分布不均匀.由此可见,虽然黑龙江苏打盐碱土(HA)和新疆荒漠盐碱土(XD)土壤中古细菌群落具有较高的物种数量,但是群落多样性和均匀度差.该结果表明两个内陆盐碱土壤中古细菌群落中的优势种群具有明显的优势性.

维恩图可以直观地表现 5种不同类型盐碱土壤古细菌群落的OTU数目组成相似性、重叠情况以及特异性(图 1B).五种盐碱土壤之间存在共有古细菌OTU数量为 193,占总 OTU数量的 7%.其中130个OTU(67%)分布在五个样品土壤古细菌群落的优势古细菌群落中,99个古细菌 OTU属于广古菌门(Euryarchaeota),31个古细菌 OTU属于奇古菌门(Thaumarchaeota).黑龙江苏打盐碱土(HA)、山西平原盐碱土(SY)、新疆荒漠盐碱土(XD)、天津滨海盐碱土(TB)、江苏滨海盐碱土(JD)盐碱土壤中特异性古细菌OTU数量分别为169、56、54、39、16,其中黑龙江苏打盐碱土(HA)的特异性古细菌 OTU数量最多,是特异性古细菌 OTU数量最少的江苏滨海盐碱地(JD)的 10.6 倍.

2.3 五种盐碱土壤古细菌群落组成

应用Unifrac方法将所有处理古细菌OTU进行加权的聚类分析,即在考虑 OTU序列的数量和进化关系的基础上,计算各个样品间的聚类关系,五个盐碱土壤样品中古细菌群落在门分类水平上的分布比例见图 2.五个样品中古细菌群落结构组成情况相似,但各类古细菌类群所占比例均有差异.通过聚类树可以看出五个不同盐碱土壤样品间的相似性,样品越靠近,枝长越短,说明 2个样品的物种组成越相似,五个样品中黑龙江安达苏打盐碱土(HA)与其他土壤样品差异较大.所有样品中古细菌优势群落主要隶属于广古菌门(Euryarchaeota)和奇古菌门(Thaumarchaeota)(比例大于总测序量的1%).广古菌门在新疆荒漠盐碱土(XD)、山西平原盐碱土(SY)、江苏滨海盐碱土(JD)、天津滨海盐碱土(TB)中占主要优势,所占相对丰度分别为 52.9%、67.8%、79.2%和 63.3%,而在黑龙江苏打盐碱土(HA)中较少(3.0%).奇古菌门(Thaumarchaeota)在黑龙江苏打盐碱土(HA)中占主要优势,所占比例为 72.7%.在其余盐碱土中依次为11%(SY)、8.8%(TB)、8.6%(XD)和 2.8%(JD).

图2 五种盐碱土壤古细菌在门分类水平群落结构Fig.2 Archaeal community composition at phylum level in five kinds of saline-alkali soils

五个盐碱土壤样品中古细菌群落在属分类水平的分布情况见图 3.五个样品中古细菌群落结构组成和主要优势属(Top 10)所占比例均有较大差异.其中黑龙江苏打盐碱土(HA)中占优势的古细菌菌属和相对丰度分别为 Nitrososphaera (62.3%)和Cenarchaeum(餐古菌属,9.8%).新疆荒漠盐碱土(XD)中占优势的古细菌菌属分别为 Haloterrigena(盐陆生菌属,20.2%)、Cenarchaeum (餐古菌属,8.2%)、Halanaeroarchaeum(4.9%)、Halorubrum(盐红菌属,3.8%)和 Natronomonas(嗜盐碱单孢菌属,1.3%).山西平原盐碱土(SY)中占优势的古细菌菌属分别为Cenarchaeum(10.2%)、Natronomonas(嗜盐碱单孢菌属,8.1%)、Halogranum(7.5%)、Haloplanus(盐盘菌属,5.2%)、Halanaeroarchaeum(2.9%)和 Halorubrum(盐红菌属,1.6%).江苏东台滨海盐碱土(JD)中占优势的古细菌菌属分别为Halorubrum(盐红菌属, 24.4%)、Natronomonas(嗜盐碱单孢菌属,9.2%)、Natronobacterium(嗜盐碱杆菌属,5.1%)、Halobellus(4.9%)、Halanaeroarchaeum(4.3%)、Haloterrigena(盐陆生菌属,3.1%)、Haloplanus(盐盘菌属,3.0%)和Cenarchaeum(餐古菌属,2.6%).天津滨海滨海盐碱土(TB)中占优势的古细菌菌属分别为Halorubrum(盐红菌属,15.6%)、Cenarchaeum (餐古菌属,8.5%)、Halanaeroarchaeum (5.2%)、Haloplanus(盐盘菌属,4.2%)、Natronomonas(嗜盐碱单孢菌属,3.6%)和Halobellus(1.8%).除主要优势属(Top 10)外,5个盐碱土壤样品中还分别注释到 29个属(HA,总相对丰度1.2%)、34个属(XD,总相对丰度8.0%)、32个属(SY,总相对丰度10.7%)、29个属(JD,总相对丰度9.5%)、33个属(TB,总相对丰度 8.2%).此外,5个盐碱土壤样品中分别有 26.7%(HA)、53.6%(XD)、53.8%(SY)、33.8%(JD)和52.9%(TB)的OTU序列无法利用数据库注释出物种类型,说明5个盐碱土壤中栖息着大量未知的古细菌类群.

图3 五种盐碱土壤古细菌的Top 10菌属相对丰度Fig.3 The relative abundance of the Top 10archaeal in five kinds of saline-alkali soils

根据五个不同盐碱地在属水平的物种注释及丰度信息,选取丰度排名前 35的古细菌属及其在每个样品中的丰度信息绘制热图,并从分类信息和样品间差异两个层面进行聚类(图4).在Top 35的古细菌属中,只有Cenarchaeum、Nitrososphaera属于奇古菌门(Thaumarchaeota),其余均属于广古菌门(Euryarchaeota)且其中绝大部分为嗜盐古菌.五个土壤样品中古细菌群落分布各有差异,都有各自特有的古细菌. Halalkalicoccus和Nitrososphaera 2个属主要分布于黑龙江苏打盐碱土(HA);Halolamina、Haloterrigena、Methanohalophilus、Halovivax 和Natronorubrum 5个属主要分布于新疆荒漠盐碱土(XD);Salinarchaeum、Halarcgaeum、Halosimplex、Halohasta、Salinirubrum、Halogranu和Halomicroarcula 7个属主要分布于山西平原盐碱土(SY);Halorubrum、Halobellus、Halapricum、Halobaculum、Halomicrobium、Natronoarchaeum、Halogeometricum、Halopenitus和Natronobacterium9个属主要分布于江苏滨海盐碱土(JD);Halorubellus、Haloarcula、Halonotius、Haloarchaeobius、Halorhabdus、Halopelagius和Haladaptatus7个属主要分布于天津滨海盐碱土(TB).

图4 五种盐碱土壤样品Top 35的古细菌属相对丰度及聚类分布热Fig.4 The heatmap of archaeal genus at Top 35level from five kinds of saline-alkali soil samples

2.5 五种盐碱土壤古细菌群落构成与盐碱环境理化特性相关分析

典范对应分析(CCA)是一种非线性多元直接梯度分析方法,它把对应分析与多元回归结合起来,由于每一步的计算结果都将微生物群落数据与环境因子进行回归,因此 CCA排序能够很好地反应古细菌群落在特征因子梯度上的分布[25].将5个样品的古细菌群落、相对丰度大于5%的优势古细菌菌属与土壤样品的pH以及所含的HCO3-/CO32-、Cl-、SO42-离子进行CCA分析(图5).CCA1和CCA2的特征值分别是52.22%和24.8%,说明这几个因子能够很好地解释古细菌群落结构的变化.图中分布的散点可以看出微生物群落结构分布,箭头越长说明,说明这个因素对微生物群落结构影响越大.

5个盐碱地样品的CCA分析显示其分为明显的3个区域.黑龙江苏打盐碱土(HA)古细菌群落,尤其是优势菌属Nitrososphaera与土壤HCO3-/CO32-含量和pH呈现出明显的相关性,说明HCO3-/CO32-和 pH 对黑龙江苏打盐碱土(HA)古细菌群落结构的形成具有较大影响,且 Nitrososphaera属较适合生存于 pH及HCO3-/CO32-含量较高的盐碱土环境.江苏滨海盐碱土(JD)、山西平原盐碱土(SY)和天津滨海盐碱土(TB)古细菌群落CCA距离较近,说明这3个地区的古细菌群落较为相似,尤其是优势菌属 Halorubrum、Natronomonas、Halogranum、Haloplanus和Natronobacterium与土壤较高的Cl-含量相关,说明Cl-对这三个地区古细菌群落结构的形成具有较大影响.且上述5个古细菌属较适合生存在Cl-含量高的盐碱土环境.新疆荒漠盐碱土(XD)的古细菌群落,尤其是Haloterrigena和Halanaeroarchaeum两个属与SO42-具有较高的相关性,说明SO42-对新疆荒漠盐碱土(XD)中古细菌群落结构的形成具有较大影响,且Haloterrigena和Halanaeroarchaeum两个属较适宜生存于SO42-含量高的盐碱土环境.从图5中还可以看出,在 5个盐碱地样品中均存在的奇古菌门的Cenarchaeum不受土壤pH及阴离子的影响.由此可见,我国不同地区不同阴离子类型的盐碱土土壤中古细菌群落的分布与盐碱土中HCO3-/ CO32-、Cl-、SO42-的含量有密切的关系.

图5 五个样品中古细菌群落与环境因子的相关性Fig.5 Correlation between the archaeal community and environmental factors in five samples

3 讨论

3.1 盐碱土古细菌群落对不同土壤阴离子类型的响应

通过对我国五种不同地区盐碱土土壤阴离子类型和含量的检测,发现黑龙江苏打盐碱土(HA)以重碳酸根离子(HCO3-)和碳酸根离子(CO32-)为主要土壤阴离子且pH最高、新疆荒漠盐碱土(XD)以硫酸根离子(SO42-)为主要土壤阴离子、山西平原盐碱土(SY)以氯离子(Cl-)和硫酸根离子(SO42-)为主要土壤阴离子、江苏滨海盐碱土(JD)和天津滨海盐碱土(TB)均以氯离子(Cl-)为主要土壤阴离子且天津滨海盐碱土(TB)中Cl-最高,这符合各地区盐碱土土壤主要阴离子的分布特征.通过对五个土壤样品中古细菌群落 16S rRNA 基因片段进行高通量测序研究,结果表明,新疆荒漠盐碱土(XD)和黑龙江苏打盐碱土(HA)中土壤古细菌群落具有最高的丰富度,但多样性和均匀度差,说明古细菌中优势种群优势明显,山西平原盐碱土(SY)土壤古细菌群落多样性最高且均匀度最好.在五个土壤样品中古细菌包括广古菌门、奇古菌门、泉古菌门,优势群落主要隶属于广古菌门和奇古菌门.其中广古菌门在新疆荒漠盐碱土(XD)、山西平原盐碱土(SY)、江苏滨海盐碱土(JD)、天津滨海盐碱土(TB)中均为最优势菌群,而奇古菌门在黑龙江安达苏打盐碱土(HA)中为最优势菌群.在五个土壤中检测到的泉古菌门的丰度很少,这可能与土壤本身性质及其中包含的其他微生物不适宜泉古菌门生长有关,且泉古菌是一类大多为依赖硫的超极端微生物,在海洋中分布比较广泛[26].黑龙江苏打盐碱土(HA)中古细菌与其他不同地区分布的不同土壤阴离子类型的盐碱土差异最大,可能是受土壤阴离子(HCO3-/CO32-)和pH的影响.新疆荒漠盐碱土(XD)中古细菌主要受 SO42-影响,而山西平原盐碱土(SY)、江苏滨海盐碱土(JD)和天津盐碱土(TB)主要受Cl-影响.

在五个土壤样品中发现的43个古细菌属中有37个属于广古菌门的嗜盐菌纲(Halobacteria),其中除东北黑土外,均为优势.五个土壤样品古细菌群落中嗜盐菌纲(Halobacteria)丰度由高到低依次为江苏东台滨海盐碱土(JD)(79%)、山西运城平原盐碱土(SY)(68%)、天津滨海盐碱土(TB)(63%)、新疆达坂城荒漠盐碱土(XD)(51%)、黑龙江安达苏打盐碱土(HA)(2%).传统意义上属于古菌域、广古菌门的嗜盐古菌纲的全部物种都是嗜盐古菌[27].嗜盐古菌的许多蛋白质在低盐环境中不起作用,因而是一类需要生长在高盐环境中的古菌,其驱动着盐环境生态系统的生物地球化学循环[28].目前,嗜盐古菌大多是从海洋、盐(碱)湖、晒盐场、盐碱土壤和人工盐制品等高盐环境中分离得到的[23].此外,五个土壤样品发现的广古菌门下与甲烷反应有关的古菌含量很少,可能由于甲烷反应需要厌氧条件,而供试样品是0～20cm的表层土壤[30].

黑龙江盐碱土中以奇古菌门为主要优势类群.该古菌菌门在海洋、淡水、土壤和沉积物中都有大量分布.其中最广为人知的是氮素地球化学循环过程中发挥重要转换作用的氨氧化古菌(Ammoniaoxidizing archaea,AOA)[31].AOA可以将环境中的氨离子氧化为亚硝酸盐,是硝化作用的第一步骤[32].2005年Könneke等[33]从海洋沉积物中分离了一株属于化能自养型的温泉古菌 Nitrosopumilus maritimus SCM1,能够以 NH4+作为唯一能源,通过将 NH4+氧化成为 NO2-而获得生长,这是首次在实验室条件下获得氨氧化古菌纯培养菌株.目前已知的 AOA类群包括 group I.1a、group I.1b、ThAOA 和 group I.aassociated[34].在大多数水生和陆地生态系统中,AOA的amoA基因数量及表达量普遍高于AOB的amoA基因数量[35],AOA丰度高及高效的基因表达说明AOA对土壤生态系统的氮循环可能起着非常重要的作用.本研究中黑龙江盐碱土 HA中富含的奇古菌门主要属于Nitrososphaera.Nitrososphaera是一类以重碳酸盐为碳源、利用铵态氮氧化产生细胞能量进行化能无机自养生长的微生物.我们的结果可以发现在五个土壤样品中Nitrososphaera为主的AOA主要存在于黑龙江安达苏打盐碱土(HA)中,这可能与HA中重碳酸盐和碳酸盐含量最高相关.该结果也说明古菌主导的硝化作用可能是黑龙江苏打盐碱土中微生物所决定的重要的一种生物地球化学循环过程.

3.2 高通量测序在土壤微生物中的应用

近年来,以一代测序技术为基础的一些分子生态学技术,例如 PCR-DGGE技术和克隆文库技术,是普遍使用的土壤微生物研究方法.申卫收等[36]使用PCR-DGGE法分别对绰墩山古代和现代水稻田土层及过渡层之间的古菌群落进行分析,发现水稻的种类和耕作条件对古菌群落结构的改变有一定程度的影响.孟祥伟等[37]利用克隆文库技术分析了西藏米拉山土壤古菌16S rRNA及amoA基因多样性,发现西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌多样性比较丰富,优势菌群和获得的氨氧化古菌都属于泉古菌门.然而,随着高通量测序技术的出现,彻底改变了微生物群落多样性的研究方法.高通量技术可以检测到低丰度的微生物,更能展现出群落结构丰富的多样性,而且速度快,结果准确[38-39].因此,高通量测序技术逐渐成为目前分子生态学研究中应用最普遍的新一代测序技术,且已经被应用到盐碱土微生物群落多样性研究领域.夏围围等[40]通过高通量测序和DGGE技术对新西兰典型草地和森林土壤的微生物群落的组成、丰度和多样性进行分析,结果表明高通量测序能够较为全面和准确的反映土壤微生物群落结构,而DGGE仅能够反映有限的优势微生物类群,在很大程度上极可能低估土壤微生物的物种组成并高估其丰度.牛世全等[41]应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析河西走廊地区盐碱土壤(原生盐碱土、次生盐碱土、农田土)微生物多样性,发现该地区盐碱土壤中微生物多样性非常丰富,存在大量的微生物类群,次生盐碱土与农田土微生物群落差异较小且多样性最高.本研究将基于 Illumina平台的高通量测序技术应用于盐碱土古细菌的研究,相较于传统的纯培养和以 16S rRNA为基础的非培养方法,该技术可以检测到以往没有检测到的、可能扮演着重要角色的低丰度(相对丰度小于 1%)土壤古细菌菌属,为更准确地认识和开发极端环境中古细菌资源提供了重要的参考.

4 结论

4.1 采自我国不同地区的5个盐碱土样品具有不同比例含量的HCO3-、CO32-、Cl-和 SO42-等 4 种土壤阴离子,且可以此为依据划分成不同的盐碱土类型.

4.2 供试的五种盐碱土壤古细菌优势群落主要集中于广古菌门和奇古菌门.不同样品间古细菌群落结构组成和主要优势属所占比例均有较大差异.黑龙江苏打盐碱土以奇古菌门的 Nitrososphaeria纲为主,其余土壤样品以广古菌的嗜盐古菌纲为主.

4.3 黑龙江苏打盐碱地、新疆荒漠盐碱地、山西平原盐碱地、江苏滨海盐碱地和天津滨海盐碱地中最优势的古细菌菌属分别为 Nitrososphaera (62.3%)、Haloterrigena (20.2%), Cenarchaeum (10.2%),Halorubrum (24.4%)和Halorubrum (15.6%).

4.4 供试盐碱土土壤的不同阴离子类型可能驱动了盐碱土壤古细菌群落的分布和结构多样性.