河南省主栽油茶品种抗寒性研究

邓全恩，丁向阳，李建安

（1. 中南林业科技大学 a.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；b.经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室；c.经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心，湖南 长沙 410004； 2. 河南省林业科学研究院，河南 郑州 450008）

油茶Camellia oleifera Abel.属山茶科Theaceae山茶属Camellia L.常绿灌木或中乔木，是指山茶科山茶属植物中油脂含量较高且具有栽培经济价值的一类植物的总称[1]。茶油的不饱和脂肪酸含量超过90%，其食用与保健品质远超常规食用油，被誉为“东方橄榄油”[2-3]。近年来，油茶作为最具代表性和发展潜力的木本食用油料树种受到国家和地方各级政府的高度重视，种植区域逐渐扩大，而作为传统的南方树种，在原产地的发展潜力有限，所以油茶新造林区域逐渐北移，在湖北省、安徽省北部及河南省南部的油茶生长北缘地区发展迅速。发展油茶产业不仅能获得经济效益，还能兼获生态效益和社会效益，符合我国脱贫攻坚和生态发展的政策导向。

油茶在我国已有2 300多年的栽培历史，主要分布在我国中南部地区（18°21′～34°34′ N、98°40′～121°40′ E），集中分布在湖南、江西、广西、浙江、福建等省区[4]。油茶喜温，要求年平均气温16～18 ℃，花期平均气温12～13 ℃[5]。近年来，专家学者对油茶的抗寒性进行了诸多研究，涉及到的研究方向和方法包括叶片石蜡切片观测叶片组织结构与抗寒的关系[6]、以生理生化指标评价油茶品种抗寒性的研究[7-11]、油茶抗寒分子的初步研究[12]、油茶生长北限抗寒品种及优良单株的选育[13-14]及提高油茶抗寒能力措施的研究等方面[15]。为给将来河南省油茶良种的选育、引种及栽培区划提供理论依据，对河南省主要油茶栽培品种抗寒性差异及生理机理进行了研究，现将研究结果分析报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为6～8年生、长势良好的‘长林4号’‘长林40号’‘长林27号’‘XL210’‘大别山1号’‘豫油茶1号’等普通油茶品种，分别种植于河南省信阳市的光山县、新县和商城县。

1.2 方 法

于2018年1月取健康结果枝的第3～4片成熟叶片。将叶片用去离子水洗净后均分成6 份，分别置于低温恒温槽进行低温胁迫处理，处理温度分别设为0、-5、-10、-15 和 -20 ℃，共设5个温度梯度。低温处理12 h 后将材料取出放入冰箱（4 ℃）解冻24 h，解冻后将每组平均分成3份，每份3次重复，测定各组材料的相对电导率、游离脯氨酸、丙二醛、可溶性蛋白含量等生理指标。

相对电导率（REC），采用电导率仪法进行测定。拟合Logistic方程，确定各植株的LT50，以测得的电导率计算相对电导率；并拟合 Logistic回归方程：y＝k/(1＋ae－bx)。式中的k为细胞伤害率饱和容量，根据陈建勋[16]的观点，如果y为累计频率，则常数k为100%；a、b为方程参数，将方程进行线性化处理，求得a、b值，用曲线的拐点作为半致死温度，即X＝-lna/b，即半致死温度。丙二醛含量，采用硫代巴比妥酸（TBA）法进行测定；游离脯氨酸含量，采用酸性茚三酮显色法进行测定；可溶性蛋白含量，采用考马斯亮蓝G-250 染色法进行测定[17]。

采用隶属函数值法综合评价不同普通油茶品种的抗寒性。如果抗寒指标与抗寒性呈正相关，则其计算公式为：

U(Xi)＝(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

如果抗寒指标与抗寒性呈负相关，则计算公式为：

U(Xi)＝1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中：U(Xi) 是 i 样品某个指标的隶属函数值；X代表i样品某个指标均值；Xmax是所有材料中某个指标的最大值；Xmin是所有材料中某个指标的最小值。将每个树种越冬期间各指标的抗寒性隶属函数值累加起来，求其平均值，均值越大则表明其抗寒性越强[18]。

分别使用软件Excel 2010和SPSS 19.0进行数据计算、Logistic 拟合及差异性分析，使用软件Origin Pro 9.0制图。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对不同油茶品种电导率的影响

低温胁迫下不同油茶品种叶片相对电导率的变化情况如图1A所示。由图1A可知，油茶叶片相对电导率随胁迫加强而逐渐升高，即电导率和胁迫温度呈负相关，电导率在20%～80%之间，说明随着温度降低，油茶叶片细胞膜受到的伤害逐渐增强。6个油茶品种在低温胁迫下其电导率的变化规律基本一致，同一品种在不同低温胁迫下的电导率存在显著差异（P＜0.05），不同品种在同一温度胁迫下的电导率也均存在显著差异（P＜0.05）。电导率随着温度降低而变化的过程基本可以分为3个阶段：0～-5 ℃胁迫下，电导率缓慢升高；-5～-10 ℃胁迫下，电导率则大幅升高；-10～20 ℃胁迫下，电导率的增幅又减缓，基本趋于停滞状态；其总体上呈现“S”形的变化趋势。从图1A中可以看出，长林系列油茶和‘XL210’品种油茶的电导率较为接近，明显高于‘大别山1号’和‘豫油茶1号’，说明前4个油茶品种的抗寒性不如后2个油茶品种的强，‘大别山1号’的抗寒性最强，‘长林4号’的抗寒性最弱。

以油茶叶片相对电导率拟合的 Logistic方程求得的半致死温度见表1。由表1可知，拟合度在0.95～0.98 之间，均达到极显著水平。‘长林4号’‘长林40号’‘长林27号’‘XL210’‘大别山1号’‘豫油茶1号’的低温半致死温度分别为-6.31、-8.30、-7.51、-8.34、-9.92、-8.72 ℃。

表1 河南省不同油茶栽培品种叶片的低温半致死温度†Table 1 The parameters of LT50 dynamics of of Camellia oleifera in Henan province

2.2 低温胁迫对不同油茶品种丙二醛含量的影响

低温胁迫下不同油茶品种叶片丙二醛含量的变化情况如图1B所示。由图1B可知，油茶叶片丙二醛含量随胁迫加强而逐渐升高。低温胁迫下6个油茶品种叶片丙二醛含量的变化规律基本一致，同一品种在不同低温胁迫下和不同品种在同一温度胁迫下叶片的丙二醛含量间均存在显著差异（P＜0.05）。丙二醛含量随着温度降低而变化的过程基本可以分为3个阶段：0～-5 ℃胁迫下，丙二醛含量缓慢升高；-5～-10 ℃胁迫下，其含量大幅升高；-10～-20 ℃胁迫下，其增幅又减缓，基本趋于停滞状态；总体上呈现“S”形变化趋势。从图1B中可以看出，长林系列油茶和‘XL210’品种油茶叶片丙二醛的含量较为接近，明显高于‘大别山1号’和‘豫油茶1号’，说明前4个油茶品种的抗寒性不如后2个油茶品种的强，‘大别山1号’的抗寒性最强，‘长林4号’的抗寒性最弱。

2.3 低温胁迫对不同油茶品种游离脯氨酸含量的影响

低温胁迫下不同油茶品种叶片游离脯氨酸含量的变化情况如图1C所示。由图1C可知，不同油茶品种叶片的游离脯氨酸含量均随温度的降低而升高，同一品种在不同低温胁迫下和不同品种在同一温度胁迫下叶片的游离脯氨酸含量也均存在显著差异（P＜0.05）。其含量变化过程同样经历了3个阶段，但和电导率变化趋势不同的是：0～-5 ℃胁迫下，游离脯氨酸含量迅速升高；-5～-15 ℃胁迫下，其含量缓慢增长；-15～-20 ℃胁迫下，其含量迅速增高。不同品种叶片的游离脯氨酸含量均随温度的降低而增加，其变化规律和电导率的相反。从图1C中可以看出，长林系列油茶和‘XL210’品种油茶叶片的游离脯氨酸含量较为接近，明显低于‘大别山1号’和‘豫油茶1号’，说明前4个油茶品种的抗寒性不如后2个油茶品种的强，‘大别山1号’的抗寒性最强，‘长林4号’的抗寒性最弱。

2.4 低温胁迫对不同油茶品种可溶性蛋白含量的影响

低温胁迫下不同油茶品种叶片可溶性蛋白含量的变化情况见图1D。由图1D可知，油茶叶片可溶性蛋白含量随温度的降低呈先升后降的变化趋势，其变化过程大致可分为4个阶段：0～-5 ℃胁迫下，可溶性蛋白含量缓慢增加；-5～-10 ℃胁迫下，其含量迅速增加并达到最大值，随后下降；10～-15 ℃胁迫下，其含量缓慢下降；-15～-20 ℃胁迫下，其含量迅速下降，但还是高于0 ℃胁迫下的测定值。同一品种在不同低温胁迫下和不同品种在同一温度胁迫下其丙二醛含量间也均存在显著差异（P＜0.05）。由图1D可见，长林系列油茶和‘XL210’品种油茶叶片的可溶性蛋白含量较为接近，明显低于‘XL210’‘大别山1号’和‘豫油茶1号’，说明前3个油茶品种的抗寒性不如后3个油茶品种的强，‘大别山1号’的抗寒性最强，‘长林4号’的抗寒性最弱。

2.5 抗寒性综合评价

植物的抗寒机制由多种物质共同调节，仅用一种指标很难准确反映植物的抗寒性。隶属函数法可以将多个抗性指标综合起来，以平均隶属度来评价植物的抗寒性。平均隶属度越大，说明植物的抗寒性越强。低温胁迫下不同油茶品种各抗寒指标的隶属函数值见表2。由表2可知，‘大别山1号’的平均隶属度（0.513 6）最高，‘长林4号’的平均隶属度（0.416 8）最低，其他4个油茶品种的平均隶属度均居中。此结果与其LT50的计算结果一致。

图1 河南主要油茶栽培品种叶片在不同低温胁迫下各抗寒指标的变化情况Fig. 1 Changes of cold resistance indexes of Camellia oleifera cultivars in Henan

表2 低温胁迫下不同油茶品种各抗寒指标的隶属函数值Table 2 Subordinate function values of cold resistance indexes of different Camellia oleifera varieties under low temperature stress

3 结论与讨论

我国幅员辽阔，以秦岭淮河为分界的南北气候差异显著，所以为了使南种北移和对抗极端低温天气，非常有必要进行植物抗寒性的研究。我国相关研究大多集中在粮食作物、蔬菜、果树的抗寒研究方面，研究内容包括形态结构、生理生化、分子机制等，取得了丰硕的成果。大量研究结果表明，低温会导致植物细胞膜脂过氧化，使其膜透性发生变化，电解质外渗，引起相对电导率的改变，并产生大量MDA。电导率越高、MDA含量越高则表明低温对细胞膜的伤害越大[18]。本研究结果表明，不同油茶品种叶片的相对电导率和MDA 含量均随胁迫温度的降低而上升。其中，‘长林4号’的测定值最大，‘大别山1号’ 的测定值最小，说明前者抗寒性最差，后者抗寒性最强。目前，有关长林系列油茶品种的研究报道较多，本研究结果和窦坦祥[7]的研究结果一致，虽然所选的长林品种不完全相同，但从中都可看出‘长林4号’的抗寒性较差。然而，文中测出的电导率、脯氨酸值均偏小于窦坦祥的测定值，这可能因为本实验用的材料为10年左右的油茶树叶片，而窦坦祥使用的材料为2年生的嫁接苗，且测定时间为1月底，油茶树经过了当年的低温锻炼。

在低温胁迫下，大部分植物均会积累大量的脯氨酸，以适应逆境条件下植物细胞内外渗透压的变化[19]。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，对植物无毒害作用，可参与诸多重要生理过程和物质的合成，一般抗寒性越强的植物在低温胁迫时其游离脯氨酸含量越高[20]。可溶性蛋白质是植物体内重要的渗透调节物质，在多种植物上，蛋白质的增加对抗寒性的提高有重要作用[21]。何伟[22]、于庆帆[23]对葡萄和杏的研究结果表明，植物在低温锻炼期间，细胞内可溶性蛋白含量与抗冻性呈明显的正相关，即可溶性蛋白含量随低温锻炼抗冻性的提高而增加。本研究结果印证了以上观点，其中抗寒性强的‘大别山1号’‘豫油茶1号’在低温胁迫时其游离脯氨酸和可溶性蛋白含量均显著高于其他品种。由于‘大别山1号’选育较晚，所以对其研究报道较少，本研究测定的该品种的游离脯氨酸含量和文佳等人[9]研究的结果一致。

近年来，以Logistic方程计算半致死温度与生理生化指标的隶属函数评价相结合的方法因能更加客观地评价植物的抗寒性而被人们接受[24]，但在油茶抗寒性的研究中能得以应用的还不多。本研究结果表明，‘长林4号’‘长林40号’‘长林27号’‘XL210’‘大别山1号’‘豫油茶1号’的低温半致死温度分别为-6.31、-8.30、-7.51、-8.34、-9.92、-8.72 ℃，其半致死温度和抗寒生理指标测定结果一致。植物的抗寒性不仅与其原生长地点的环境条件有关，同时受栽培技术的影响。本研究结果表明，‘大别山1号’的抗寒性最强，‘豫油茶1号’的抗寒性次之，这与此2个油茶品种选育地的环境有关，2个品种均选自于油茶的生长北限河南省和安徽省，而来源于中国亚热带湖南省和江西省的长林品种和湘林品种的抗寒性均较弱。这个结论在早实核桃上已经得到印证[25]，陈家铭[12]对同一山上不同生态区域的野生油茶品种的抗寒性进行了比较，结果也发现，海拔越高温度越低的野生油茶品种其抗寒性越强。之所以选自安徽省北部的‘大别山1号’的抗寒能力比选自于河南省南部的‘豫油茶1号’的更强，可能因为，‘豫油茶1号’选自于早年从南方油茶移栽到河南的油茶品种，而并非是本地原产油茶品种。同时，长林系列品种的抗寒性也存在差异，这是因为种间存在差异，后续研究应从分子方面进一步探索油茶抗寒机理。由于大别山系列和豫油茶系列品种选育时间晚，推广应用范围多集中在豫皖交界地带，所以前人的研究未曾将长林系列、大别山系列、豫油茶系列品种放在一起进行研究，本研究结果填补了这一空白，为河南省油茶品种引进及栽培区域规划提供了理论基础。由于河南省主要油茶栽培品种数量相较于我国其他油茶主要栽培省区（如湖南省、江西省、广西壮族自治区等）来说偏少，所以本研究结果对于某油茶品种系列而言其代表性还不够强，而且所测数据是1年的研究结果，后续研究若要从某一品系中选择适合河南省发展的油茶品种还需要扩大研究范围，也需要多年的重复数据以得到更加准确的结果。此外，油茶主要是花期容易受到低温的影响，虽然抗寒方面的研究多是从叶片的胁迫着手，对油茶而言，可以尝试对其花期的抗寒性，比如花结构的抗寒生理、花粉活力和柱头的可授性等方面进行探究。