人参皂苷Rg2立体异构体对皮层神经元抗凋亡作用的研究

皮明山，茹琴，龚晓康，田香，黎炎梅，唐利军，*，李超英，4，*

（1.江汉大学武汉生物医学研究院，湖北武汉430056；2.湖北省应用毒理学重点实验室，湖北武汉430079；3.湖北省疾病预防控制中心，湖北武汉430079；4.汉济生物科技（武汉）有限公司，湖北武汉430079）

中风是人类健康最严重的威胁之一。全球每年有超过200万的新发卒中病例和150万卒中相关死亡病例。缺血性中风占所有中风病例的87%，是导致其死亡和后遗症的主要原因[1]。虽然溶栓治疗是治疗缺血性中风的一种有效方法，但这种治疗通常会导致更为严重的脑功能障碍，称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia and reperfusion injury，CIRI），这是由复杂的机制引起的[2]。

凋亡是细胞为更好地适应生存环境而主动争取的一种细胞死亡过程，发生在许多重要的生理条件下，如胚胎发育和组织重塑[3]。许多疾病与不同程度的细胞凋亡有关，包括癌症，自身免疫，败血症和神经退行性疾病[4]。已有的研究已经证明凋亡在CIRI中也起着重要作用[5]。胱天蛋白酶-3（Caspase-3）是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用[6]。缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor，HIF-1α）是调节多种凋亡调控基因的重要核转录因子，包括可促进缺血缺氧后的血管重建和神经功能改善的促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）[7]。最近的研究表明，HIF-1α-EPO信号通路的激活在CIRI诱导的细胞凋亡中发挥重要作用[8]。

人参是中国传统的药食两用资源，已有3 000多年的历史，因其预防及治疗疾病的功效在亚洲越来越受欢迎[9-10]。许多研究表明人参中主要的生物活性成分是人参皂苷，它是人参大部分药理作用的主要有效成分，包括抗凋亡、抗癌和抗氧化活性[11-12]。此外，有研究表明，几类人参皂苷在原代培养的神经元或体外神经元模型中显示出抗凋亡作用。例如，人参皂苷Rg1在PC12细胞中可以保护β淀粉样蛋白（Aβ）诱导的细胞毒性；人参皂苷Rb1在体外对CIRI具有保护作用[13-14]。

人参皂苷 Rg2（ginsenoside-Rg2，Rg2）也是人参皂苷中的一种，能够改善动物模型的学习和记忆能力[15]，并且Rg2对心肌缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡也具有良好的保护作用[16]。值得注意的是，在我们以前的研究中已经显示了Rg2对氧糖剥离/再灌注 （oxygenglucose deprivation/reperfusion，OGD/R）诱导的皮层神经元损伤具有保护作用，并且我们推测这种保护作用可能与抗凋亡相关[17]。另外，Rg2包含两个立体异构体[20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2]，由于其碳-20 上的羟基空间结构不同[18]。结构上的差异通常会导致作用效果的不同，例如，20（R）-Rg3的抗肿瘤和免疫调节功能比 20（S）-Rg3 更有效[19]。然而，Rg2 对 CIRI诱导细胞凋亡的影响是否也具有立体异构性还未见报道。

因此，我们使用大脑皮层神经元建立OGD/R的细胞模型，该模型常用于体外模拟CIRI[20]。来探讨Rg2的立体异构体[20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2]对 OGD/R诱导的皮层神经元凋亡的影响及可能的调控机制。

1 材料和方法

1.1 动物

1日龄SD大鼠，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK-（京）-2016-0006。

1.2 试剂与仪器

20（R）-Rg2、20（S）-Rg2 ：成都曼思特生物科技有限公司；高糖改良杜氏伊格尔培养基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）、Neuronbasal培养基、2%B-27 Supplement 50×、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶：GIBCO，美国；无糖DMEM：杭州吉诺生物医药技术有限公司；多聚赖氨酸、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、三氯化氢 2-（4-乙基苯基）-5-（4-甲基-1-哌嗪基）-2，5-二-1H-苯并咪唑 [2-（4-Ethoxyphenyl）-5-（4-methyl-1-piperazinyl]-2，5-bi-1H-benzimidazole，trihydrochloride，Hoechst 33342）、碘化丙啶 （propidium iodide，PI）：Sigma，美国；Fluo-3AM ：Dojindo，日本；Caspase-3活性检测试剂盒：上海碧云天生物技术研究所；HIF-1α和EPO酶联免疫吸附测定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；

Eppen-dor 5810R台式高速冷冻离心机：Eppendorfg Inc，德国；Multiskan FC型酶标仪、CO2培养箱：Sigma，美国；Olympus IX71 型荧光显微镜：Pooher，日本；BS224S型电子分析天平：Sartorius AG，德国。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

按照参考文献[21]的细胞培养方法，取新生1日龄的SD大鼠，无菌条件下剥离软脑膜后，分离大脑皮质，剪碎脑组织，加入0.125%胰蛋白酶，于37℃、5%CO2孵箱中消化15 min后，加入DMEM稀释终浓度为10%胎牛血清终止消化，200目细胞筛网过滤，1 000 r/min离心8 min。弃上清，加入含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺的DMEM培养液（种植培养液），吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×106个/mL。以每瓶2 mL接种于多聚赖氨酸包被的25 cm2培养瓶，用于检测Caspase-3的活性；以每孔800 μL接种于6孔板，用于检测HIF-1α和EPO的含量；以每孔200 μL接种于24孔板，用于检测细胞凋亡；每孔50 μL接种于96孔板，用于检测细胞存活率。于37℃、5%CO2孵箱中培养24小时后全部换成含2%B27添加剂、1%谷氨酰胺的Neuronbasal培养液（维持培养液），以后每2天半量换液1次，培养至7 d～10 d用于试验。

1.3.2 分组及模型制备

将培养7 d的皮层神经元分成4组：对照组、模型组、20（R）-Rg2 组和 20（S）-Rg2 组。20（R）-Rg2 组及20（S）-Rg2 组分别加入浓度为 20、40、80 μmol/L 的20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2预先处理 24 h。随后模型组、20（R）-Rg2组及 20（S）-Rg2组按照参考文献[20]方法造模：各组弃去培养液，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤 2次，加入 95%N2和5%CO2预饱和的无糖DMEM培养液模拟细胞缺血缺氧状态，置于37℃低氧环境下培养2小时后换成正常的维持培养液在常规的37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，以形成再灌注，OGD/R模型制备完成；对照组不给药也不经过OGD/R处理。

1.3.3 MTT法检测细胞存活率

细胞再灌注24 h时，取出各96孔板，每组每孔均加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，继续置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内。4小时后，将各组的培养液吸弃，每孔各加入150 μL DMSO，振荡混匀10 min，在570 nm波长下用酶标仪检测各孔吸光度（OD）值，然后设对照组的吸光度值为100%存活率，计算出其他各组相对于对照组的相对存活率。

1.3.4 细胞凋亡检测

使用Hoechst/PI核染色进行细胞凋亡的形态学评估。如文献所述[22]，简言之，再灌注24 h时取出各24孔板，用PBS洗涤2次，然后向每孔中加入20 μL Hoechst33342（10 μg/mL）。紧接着在37℃避光染色20 min 后，将 15 μL PI（15 μg/mL）加入到每个孔中，25℃避光染色15 min。最后，在荧光显微镜下分别用紫外和绿光激发荧光并观察。每个孔在同一视野下，并使用紫外和绿光相同的曝光时间，将这两个图像重叠以识别细胞凋亡和坏死（原始放大倍数，×200）。使用Image J软件（原始放大倍数，×100）计数凋亡细胞。细胞凋亡率通过下式计算：细胞凋亡率/%=凋亡细胞/细胞总数×100。

1.3.5 Caspase-3活性检测

按试剂盒说明，以戍糖核酸（pentose nucleic acid，pNA）为标准品稀释成不同浓度绘制标准曲线；取出培养瓶，吸取培养液备用，用胰酶消化神经元，收集至备用培养液中，在4℃下1 000 r/min离心8 min，小心吸除上清，PBS洗涤1次，吸取上清后按每200万细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min，在4℃下10 000 r/min离心10 min后将上清转入预冷的离心管中作为样品，取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，调整浓度为1 mg/mL～3 mg/mL；设置 100 μL 反应体系（检测缓冲液 50 μL，待测样品 40 μL，荧光底物 Ac-DEVD-pNA 10 μL），加到96孔板，混匀，37℃孵育过夜；在405 nm波长下用酶标仪检测各孔OD值，然后将OD值代入标准曲线计算出相应pNA的浓度，再根据Caspase-3酶活力单位的定义计算出相应Caspase-3的活性。

1.3.6 HIF-1α和EPO表达水平的测定

为了量化HIF-1α和EPO的量，进行ELISA测定。再灌注24 h时，收集细胞后制备细胞裂解液，用相应的ELISA试剂盒按照说明书进行测定HIF-1α和EPO的蛋白表达水平。使用酶标仪在450 nm处测定各样品OD值。

1.4 统计学方法

采用统计学软件SPSS 19.0对各组数据进行统计学分析。计量数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 20（R）-Rg2和20（S）-Rg2对神经元活力的影响各组细胞存活率的比较见表1。

表1 各组细胞存活率的比较（±s）Table 1 Comparison of cell survival rates in each group（±s）

表1 各组细胞存活率的比较（±s）Table 1 Comparison of cell survival rates in each group（±s）

注：*P＜0.05表示与对照组比较差异有显著性；△P＜0.05表示与模型组比较差异有显著性；▲P＜0.05表示与20（S）-Rg2组同浓度比较差异有显著性。

组别浓度/（μmol/L）n相对存活率/%对照 6 100.0±3.6模型 6 55.6±2.4*20（R）-Rg2 20 6 77.3±2.2△▲40 6 86.1±2.5△▲80 6 96.8±1.6△▲20（S）-Rg2 20 6 69.6±2.3△40 6 78.3±2.4△80 6 90.1±2.5△

如表1所示，与对照组相比，OGD/R模型组细胞活力显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，不同浓度20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2（20、40、80 μmol/L）预处理组细胞活力均显著增加（P＜0.05）。此外，在所有测试剂量下20（R）-Rg2预处理组的细胞存活率均高于20（S）-Rg2预处理组（P＜0.05）。

有文献报道，OGD/R通常会降低神经元的活力[23]。试验结果说明20（R）-Rg2和20（S）-Rg2均能减弱了OGD/R诱导的神经元活力的受损程度。此外，天然物质的立体异构性受到越来越多的研究者关注。例如，左旋四氢巴马汀具有镇痛作用，而其右旋异构体不具有；20（R）-人参皂苷Rh2能抑制破骨细胞形成，而20（S）-人参皂甙Rh2不能[24-25]。在研究中，体外比较20（R）-Rg2和20（S）-Rg2的神经保护作用。发现20（R）-Rg2显示出比20（S）-Rg2更强的神经保护作用。

2.2 20（R）-Rg2和20（S）-Rg2对神经元凋亡的影响

20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2对 OGD/R 诱导的大鼠皮层神经元凋亡的影响见图1。

如图1A所示，与对照组比较，可以观察到模型组凋亡细胞明显增加；与模型组相比，20（R）-Rg2和20（S）-Rg2（20、40、80 μmol/L）预处理组中凋亡细胞均明显减少。由图1B可知，20（R）-Rg2和20（S）-Rg2（20、40、80 μmol/L）预处理组细胞凋亡率与模型组相比均明显降低（P＜0.05）；然而，20（R）-Rg2（40 μmol/L和80 μmol/L）预处理组细胞凋亡率均低于 20（S）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）预处理组（P＜0.05）。

图1 20（R）-Rg2和20（S）-Rg2对OGD/R诱导的大鼠皮层神经元凋亡的影响Fig.1 Effects of 20（R）-Rg2 and 20（S）-Rg2 on apoptosis of rat cortical neurons induced by OGD/R

在许多研究中，使用OGD/R细胞模型来模拟CIRI，通常能诱导培养细胞的凋亡[20，21，26]。该试验结果也说明了皮层神经元在OGD/R后可观察到明显的细胞凋亡，然而，用 20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2（20，40和80 μmol/L）预处理均可明显抑制OGD/R所诱导的凋亡增加。此外，20（R）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）比 20（S）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）更有效地抑制细胞凋亡。

2.3 20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2对 Caspase-3活性的影响

各组Caspase-3活性的比较见表2。从表2可以看出，模型组Caspase-3的活性与对照组相比明显增加（P＜0.05）；与模型组相比，20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2（20，40和 80 μmol/L）预处理组的 Caspase-3活性均明显降低。然而，20 （R）-Rg2 （80 μmol/L） 预处理组Caspase-3活性显著低于 20（S）-Rg2（80 μmol/L）预处理组（P＜0.05）。

Caspase-3是一种经常活化的死亡蛋白酶，对OGD/R引起的细胞凋亡很重要[27]。该试验结果说明，所有测试剂量的20（R）-Rg2和20（S）-Rg2均能有效抑制OGD/R所诱导的Caspase-3活性增加，并且20（R）-Rg2（80 μmol/L）比 20（S）-Rg2（80 μmol/L）能更有效地抑制OGD/R所诱导的Caspase-3活性增加。

2.4 20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2对 HIF-1α 和 EPO 表达的影响

各组HIF-1α和EPO含量的比较见表2。

表2 各组Caspase-3活性、HIF-1α和EPO含量的比较（±s）Table 2 Comparison of caspase-3 activity，HIF-1α and EPO content in each group（±s）

表2 各组Caspase-3活性、HIF-1α和EPO含量的比较（±s）Table 2 Comparison of caspase-3 activity，HIF-1α and EPO content in each group（±s）

注：*P＜0.05表示与对照组比较差异有显著性；△P＜0.05表示与模型组比较差异有显著性；▲P＜0.05表示与20（S）-Rg2组同浓度比较差异有显著性。

组别浓度/（μmol/L）nCaspase-3活性/（U/mgprot）HIF-1α含量/（ng/gprot）EPO含量/（IU/gprot）对照 6 63.0±7.4 12.0±1.2 14.7±0.1模型 6 231.6±25.0* 17.0±1.6* 19.5±0.1*20（R）-Rg2 20 6 195.8±10.0△ 18.7±2.4 19.6±1.3 40 6 173.8±18.6△ 26.2±1.0△▲ 20.5±0.2△80 6 140.4±10.2△▲ 33.2±0.9△▲ 23.1±0.1△▲20（S）-Rg2 20 6 196.9±16.6△ 17.7±2.2 19.5±1.2 40 6 180.1±17.8△ 22.1±1.3△ 20.2±0.1△80 6 161.2±10.6△ 29.3±0.8△ 21.9±0.2△

由表2可知，与模型组相比，20（R）-Rg2和20（S）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）预处理组中 HIF-1α和EPO的表达水平均显著增加（P＜0.05）。然而，20（R）-Rg2 （40 μmol/L 和 80 μmol/L） 预处理组的HIF-1α 表达水平显著高于 20（S）-Rg2（40 μmol/L 和80 μmol/L）预处理组（P＜0.05）；20（R）-Rg2（80 μmol/L）预处理组的 EPO 表达水平高于 20（S）-Rg2（80 μmol/L）预处理组（P＜0.05）。

HIF-1α与细胞凋亡密切相关，调节多种凋亡调控基因的转录。此外，许多研究报道HIF-1α在EPO的转录调控中发挥重要作用[7，28]。最近的研究也表明HIF-1α-EPO信号通路的激活在CIRI诱导的细胞凋亡中起重要作用[8]。该试验结果表明，用20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）预处理后，均能明显地激活HIF-1α-EPO信号传导通路；并且20（R）-Rg2（80 μmol/L）比 20（S）-Rg2（80 μmol/L）能更有效地激活HIF-1α-EPO信号通路。在实验中，发现模型组中HIF-1α和EPO的表达水平均显著高于对照组，从表2中可以看出。因此，绘制了OGD/R诱导皮层神经元中HIF-1α和EPO的表达量随时间的变化曲线，如图2所示。发现皮层神经元OGD/R 24小时后HIF-1α和EPO的表达水平确实高于正常组，这也与文献报道的一致[29]。

图2 HIF-1α（A）和EPO（B）随时间变化曲线Fig.2 Curves of HIF-1α（A）and EPO（B）over time

3 结论

20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2均能通过有效地抑制由OGD/R所诱导的细胞凋亡而对皮层神经元起到预防保护作用。这种保护作用机制可能与20（R）-Rg2和20（S）-Rg2下调caspase-3的活性以及激活HIF-1α-EPO信号通路有关。20（R）-Rg2比20（S）-Rg2能更有效地抑制OGD/R所诱导的细胞凋亡。因此20（R）-Rg2有潜力被用作预防CIRI的功能性食品中的有效成分之一。然而，还需要更多的体内甚至临床研究，来进一步评估20（R）-Rg2预防和治疗相关疾病的作用。