桑椹花青素的提取及其与总黄酮的比较研究

崔京燕，杨静，桑鑫燕，韩红娟，刘淑珍，樊彦玲，刘永平，赵京帅

（中北大学化学工程与技术学院，山西太原030051）

桑椹（Fructus Mori，mulberry）为多年生木本植物桑树（Morus alba L.）的成熟果穗，又名桑葚子、桑果、桑枣等。多数桑椹成熟期为5月～6月份，果实成熟后为紫红色或紫黑色，呈长椭圆形，风味独特。桑椹不仅含有丰富的维生素、氨基酸、矿物质等营养元素[1]，而且富含多种具有生物活性的小分子化合物，如黄酮和花青素，与沙棘、悬钩子（树莓）等一起被誉为药食同源的“第三代水果”[2]。黄酮类化合物和花青素的基本母核结构见图1。

图1 黄酮类化合物和花青素的基本母核结构Fig.1 The basic structure of flavonoids and anthocyanins

黄酮类化合物（flavonoids）是植物中重要的次生代谢物之一，泛指两个芳香环（A，B环），通过中央三碳桥相互连接而成的一系列化合物，基本骨架为C6-C3-C6（图1a），根据三碳桥的氧化程度，黄酮类化合物可分为黄烷酮、黄酮醇、异黄酮、花青素等[3]。花青素（anthocyanins）是一种广泛存在于植物中的水溶性天然色素，母核结构为2–苯基苯丙吡喃（图1b），即花色苷元[4]。花色苷元B环各碳位上取代基的不同，使得花青素种类繁多。桑椹中富含的花青素种类主要为矢车菊-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-3-O-芸香糖苷[5]。研究表明，不仅矢车菊-3-O-葡萄糖苷可抑制大鼠主动脉血管平滑肌细胞肿瘤坏死因子迁移[6]；而且花青素粗提物也可以抑制肺癌细胞的入侵与扩散，具有较高的药用价值[7]。桑椹总黄酮种类主要为槲皮素-3-芸香糖苷（芦丁）、槲皮素-3-葡萄糖苷和槲皮素-3-丙二酰葡萄糖苷，而槲皮素-3-葡萄糖苷已经被证明可通过诱导低密度脂蛋白受体抑制胆固醇增多[8]，预防心血管疾病，另外桑椹总黄酮粗提物也具有清除氧自由基，抗衰老的作用[9]。因此，桑椹中总黄酮与花青素的粗提物和单品具有消炎抗癌、抗衰老和降血压等重要作用，在药品、食品、化妆品等行业有着巨大的应用潜力。

然而，桑椹具有成熟期短且易腐难存的弊端，其营养价值和药用价值均未得到充分开发利用，存在巨大的资源浪费问题。根据研究报道，桑椹成熟过程中总黄酮与花青素含量变化规律不同，花青素主要在全红期至紫黑期的发育阶段合成，而总黄酮在幼果期和成熟期各有一个合成高峰[10]。由于花青素属于总黄酮类化合物的衍生物，二者的合成酶及产生途径具有一定相关性[11]，可依据二者合成规律调控不同药用成分含量，对不同阶段桑椹进行不同成分的提取利用，为桑椹的综合开发利用提供依据。

所以，桑椹的集中采收，活性成分提取、分离和加工有助于更好地开发利用桑椹和桑树资源。超声辅助提取法由于快速、简单、成本低、提取率高，且不依赖大型设备等优点，是目前从植物细胞、果实、叶片等材料中提取天然产物最常用、有效的方法之一[12]。杨松[13]采用四元二次正交旋转组合设计，研究影响超声辅助提取药桑果实花青素的主要因素是：乙醇浓度（52.46%～55.93%）、液料比[39.51 ∶1（mL/g）～42.43 ∶1（mL/g）]、超声时间（27.77 min～32.23 min）、超声温度（50.18℃～52.4℃）。

本文以市售水果桑椹（果桑）为原料，采用响应面法优化桑椹花青素的超声辅助提取工艺。使用桑椹花青素最优提取工艺并参考杨静等[14]的方法分别对果桑、药用桑椹干果（药桑）、自植盛果期粉红桑椹（粉桑）和紫黑桑椹（黑桑I）及自植败果期紫黑桑椹（黑桑II）进行花青素和总黄酮提取，对不同品种、成熟期、颜色等桑椹中花青素与总黄酮进行提取和测定比较，为桑椹的采后分拣加工提供数据支持，有利于桑树资源的综合开发利用。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

2017年5 月～7月间收集5类桑椹。（1）果桑：市售水果桑椹，水分含量约85%，中北大学森德超市；（2）药桑：药用桑椹干果，河北汉草堂药业有限公司，收集于山东；（3）粉桑：晋桑1号，2017年5月采自中北大学实验田，粉红色桑椹（＞50%果实转为粉红色），水分含量约为 77%；（4）黑桑 I：晋桑 1号，2017年 6月中北大学实验田，盛果期紫黑桑椹（＞50%果实转为紫黑色），水分含量约 80%；（5）黑桑 II：晋桑 1 号，2017 年7月采自中北大学实验田，败果期紫黑桑椹（全树果实＜10%，紫黑色），水分含量约73%。置于电热鼓风干燥箱中，温度60℃，烘干至室温恒重。将烘干处理后的桑椹置于研钵中，研磨至均匀粉末状，存放于常温干燥处备用。

无水乙醇、盐酸、氯化钾、无水乙酸钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；YH-A3003电子天平：瑞安市英衡电器有限公司；PHS-3C数显酸度计：杭州奥立龙仪器有限公司；JOYN-15AL超声波清洗机：上海乔跃电子有限公司，40 KHz；TGL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器制造厂；721E紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；PCB-1500紫外可见光谱分辨仪：珀金埃尔默股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 桑椹的提取工艺流程

桑椹粉末浸泡于提取液→超声辅助提取→离心（12 000 r/min，10 min）→取上清液即得桑椹提取液

1.2.2 桑椹花青素最大吸收波长的测定

取0.25 mL提取液于试管中，加入pH 1.0氯化钾-盐酸缓冲液（0.2 mol/L）9.75 mol/L，摇匀，避光平衡100 min[15-16]。以蒸馏水为空白，在200 nm～700 nm波长下进行全波段光谱扫描，确定桑椹花青素在可见光区的最大吸收波长。

1.2.3 pH示差法测定桑椹花青素提取率。

取0.25 mL和0.5 mL提取液，分别用pH 1.0氯化钾–盐酸缓冲液（0.2 mol/L）和pH 4.5乙酸钠-盐酸缓冲液（0.2 mol/L）定容至 10 mL，避光平衡 100 min[16-17]。以蒸馏水为空白，分别在最大吸收波长和700 nm处测定吸光度值。花青素提取率计算公式为：

式 中 ：A=（Aλmax-A700nm）pH1.0-（Aλmax-A700nm）pH4.5；MW（矢车菊-3-葡萄糖苷分子量）=449.2 g/mol；DF为稀释倍数；V为提取液体积，mL；ε（摩尔消光系数）=26 900 L/mol·cm；L 为光程，cm；m 为样品干重，g。

1.2.4 单因素试验设计

以果桑为样品，称取（1±0.002）g样品，以50%乙醇20 mL作提取液，pH值为2.0，在160 W、60℃超声条件下提取30 min为工艺基础，分别研究液料比（20∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1 mL/g）、提取液 pH（2、3、4、5、6）、乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）、超声时间（0、15、30、45、60 min）、超声温度（30、40、50、60、70 ℃）和超声功率（0、100、150、200、250 W）6个单因素条件对桑椹花青素提取率的影响，重复3组。

1.2.5 响应面试验设计

在单因素试验基础上，确定影响桑椹花青素提取率较为显著的因素，即液料比、提取液pH值、乙醇浓度和超声时间，以桑椹花青素提取率为响应值，采用Box-Behnken模型优化桑椹花青素的提取工艺条件，各因素水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素及水平Table 1 Plackett-Burman experimental factor and level

1.2.6 不同品种桑椹中花青素和总黄酮的含量比较

根据响应面试验得出的最优提取工艺条件，对果桑、药桑、黑桑I、黑桑II和粉桑进行花青素提取，并用pH示差法测定不同种桑椹中花青素的含量；根据杨静等[14]对总黄酮的提取方法，取（1±0.002）g桑椹样品，加入60%乙醇10 mL，采用超声功率160 W、超声温度60℃、超声时间30 min的提取条件，对各种类桑椹样品进行总黄酮提取，并根据标准曲线回归方程A=13.344C-0.001 1，计算各桑椹样品中总黄酮的含量。

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0软件进行响应面试验设计及分析，利用SPSS 20.0软件进行检验统计，其余运用Microsoft excel软件进行数据处理，Origin 8.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 桑椹花青素最大吸收波长的测定

对桑椹提取液进行紫外-可见全波段光谱扫描，桑椹花青素的光谱扫描图见图2。

图2 桑椹花青素的光谱扫描图Fig.2 UV-Vis absorption spectrum of mulberry anthocyanins

由图2可见在280nm和514nm波长处分别有两个强吸收峰，这与颜色较深的花色苷在紫外光区270 nm～280 nm和可见光区465 nm～550 nm（特别是520 nm左右）波长处分别有两个特征吸收峰的报道相符[18]。由此确定桑椹提取液为花色苷成分，并且在可见光区的最大吸收波长为514 nm。

2.2 单因素试验结果

各提取参数对桑椹花青素提取率的影响见图3。

图3 各提取参数对桑椹花青素提取率的影响Fig.3 Effects of different parameters on the extraction ratio of mulberry anthocyanins

在设定的单因素条件下，花青素提取率均呈现先升高再降低的趋势，其中，提取率最大值的对应条件分别为：液料比 50 ∶1（mL/g）（图3a），提取液 pH 3.0（图3b），乙醇浓度 70%（图3c），超声时间 30 min（图3d），超声温度 60 ℃（图3e），超声功率 150 W（图3f）。此外，不同单因素条件下，花青素提取率的最大值与最小值的比率分别为72.92%（液料比）、66.13%（提取液pH值）、87.65%（乙醇浓度）、68.18%（超声时间）、24.14%（超声温度）、21.21%（超声功率），即液料比、乙醇浓度、提取液pH值和提取时间对桑椹花青素的提取率影响较大，故而选取这4个因素进行进一步响应面试验设计。

2.3 响应面法试验设计及结果

2.3.1 响应面试验设计及结果

根据Box-Behnken的统计设计原理，参考单因素试验结果，固定超声功率150 W、超声温度60℃，选择液料比、提取液pH值、乙醇浓度和超声时间，进行四因素三水平试验设计，共3个中心点，27个试验点，试验结果见表2。

2.3.2 响应面法回归方程及方差分析

采用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行多元回归拟合，得到以各因素水平编码为自变量，桑椹花青素提取率为响应值的二次回归方程为：提取率（%）=1.79+0.13A-0.032B+0.24C+0.030D-0.36AB+0.067AC+0.055AD+0.28BC-0.052BD+0.083CD-0.44A2-0.28B2-0.33C2-0.63D2。

对该模型进行方差分析及显著性检验，结果见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 The experiment design and results of RSM

表3 响应面二次回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for response quadratic regression equation

续表3 响应面二次回归方程方差分析Continue table 3 Analysis of variance for response quadratic regression equation

从方差分析结果（表3）可以看出：该模型的显著水平为0.006 1（小于0.05），说明该回归方差模型是显著的。响应值与 A2、D2相关极显著，与 C、AB、B2、C2相关显著，该模型的相关系数R2为0.804 8，因变量与自变量之间线性关系显著。说明该回归方程对试验拟合情况良好，可用模型代替试验真实点对试验结果进行分析。

2.3.3 响应曲面图分析

根据上述回归方程绘制响应面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析各因素相互作用对花青素提取的影响，结果如图4所示。

图4 影响桑椹花青素提取率的各参数三维响应面图Fig.4 Three-dimensional response surface analysis of factors influencing the extraction ratio of anthocyanins from mulberry

对比图4（a）～（f）可知，桑椹花青素的提取率均随提取条件值的增加呈现先增加后减少的趋势，并且响应曲面的坡度越陡峭，说明交互作用越显著。可以看出，图4（a）的曲线最陡峭，图4（b）～（f）的曲线均次之，故液料比和提取液pH值的交互作用最显著，图形分析结果与方差分析结果一致。

2.3.4 优化与验证

通过回归模型分析，得出桑椹花青素的最佳提取工艺参数为液料比 51.75 ∶1（mL/g）、提取液 pH3.03、乙醇浓度74.03%、超声时间30.84 min，预测花青素提取率最大值为1.84%。考虑到实际操作的方便和可行性，将桑椹花青素的提取工艺调整为液料比50∶1（mL/g）、提取液pH 3.0、乙醇浓度75%、超声时间30 min，进行3次重复试验，得出桑椹花青素提取率为1.72%，比模型预测值略低6.52%，说明该模型是准确可行的。

2.4 不同品种桑椹中花青素与总黄酮含量测定结果

按照1.2.6的方法分别测定果桑、药桑、粉桑、黑桑I和黑桑II中的花青素与总黄酮含量，经SPSS软件中Duncan法分析数据结果见图5。

图5 不同桑椹品种中总黄酮与花青素含量Fig.5 Total flavonoid and anthocyanin contents of selected mulberry varieties

在被检测的桑椹花青素中，果桑和黑桑I含量最高（＞1.7%），其次是粉桑（0.86%）和黑桑 II（0.70%），最低是药桑（0.53%）；黄酮含量则表现为果桑最高（2.40%），其次是黑桑I、粉桑和药桑（0.8%～1.0%），最低是黑桑II（0.36%）。综合考虑，本试验中果桑品质最优，黑桑II品质最差。桑椹品种、颜色、成熟期等均会影响其花青素及总黄酮含量。

3 讨论

桑椹花青素和总黄酮都具有消炎、抗癌、降血压和降血脂等作用[19]，关于它们的植物源粗提物、纯化物和单品都是中西药业、食品业及化妆品行业趋之若鹜的珍品。本研究由响应面模型优化得出桑椹花青素的理论最佳工艺为液料比51.75∶1（g/mL）、提取液pH 3.03、乙醇浓度74.03%、超声时间30.84 min，提取率为1.82%。马义虔等[17]采用响应面Box-Behnken模型设计，得出超声辅助提取桑椹中花青素的最佳条件为乙醇浓度60%，提取液pH2.0，超声温度53℃，超声时间35 min，冷凝回流提取两次得到花青素含量为259.50 mg/100 g；Dranca等[20]同样采用响应面Box-Behnken模型设计，得出超声辅助提取茄子皮中花青素的最佳条件为甲醇浓度54.4%，超声频率37 kHz，超声温度55.1℃，超声时间44.85 min，花青素含量241.07 mg/100 g。本试验中提取工艺的研究材料为市售桑椹，水分含量约85﹪，经计算转换，本试验提取得到桑椹花青素的含量约为258 mg/100 g（鲜重）。因此，本研究得出桑椹花青素的最优提取工艺条件及提取率与前人研究接近，且工艺流程更短更简单。

在桑椹花青素优化工艺的基础上，参考杨静等[14]的总黄酮测定方法，同期测定了果桑、药桑、粉桑、黑桑I和黑桑II中的花青素与总黄酮含量，结果显示果桑和黑桑I的花青素含量最高，而且果桑的总黄酮含量是黑桑I的3倍。据冯晨静等[21]对草莓冷温贮藏期间花青素与总黄酮含量变化规律的研究，冷藏条件下的草莓果实，花青素含量的增加趋势比较平缓，而总黄酮含量在第1天下降后又开始大量上升。因此，推测果桑中总黄酮含量高的现象可能与果桑在售出前经一定时间冷藏保存，而累积较多的总黄酮有关。药桑花青素含量最低，可能是由于花青素性质不稳定，在采后大规模干制处理过程中被大量破坏所致；而且，药桑与其它的总黄酮含量相比也没有什么优势。Wang等[22]对药用植物黑桑果实、根、枝和叶的醇提物的研究结果显示，它们的总黄酮含量相差不大，但是果实醇提物的抗氧化能力和与Fe2+的螯合能力最强，据此推测本试验中药桑的药用成分可能不是以黄酮和花青素为主，可能还有其它成分。

粉桑、黑桑I和黑桑II代表了果实成熟过程中未成熟期、成熟期和成熟后期3个阶段，花青素的变化呈现先升高再降低的趋势。王振江等[10]对桑椹成熟过程中花青素变化规律的研究显示，花青素主要在全红期至紫黑期发育阶段合成；Wang等[23]也发现草莓绿熟期及粉红期的花青素含量极微，在紫红成熟期花青素大量合成和积累。这与本试验研究中粉桑和黑桑I的花青素含量随果实成熟度、着色度增加而增加的关系一致。但是本试验结果显示粉桑和黑桑I的黄酮含量相同，是黑桑II的两倍多。这与冯晨静等[21]研究在草莓绿熟期总黄酮含量较高，随着果实的成熟，含量逐渐下降的结果不符；而王振江等[10]发现桑椹成熟过程中黄酮在幼果期和成熟期各有一个合成高峰，故而推测粉桑（幼果期）和黑桑I（成熟期）黄酮含量相同正是由于二者均处于合成高峰。因此，关于桑椹果实中花青素与总黄酮的变化规律可能需要更细致更深入的研究。此外，黑桑II虽然颜色积累及外观形态已达到成熟状态，但其营养条件及生长环境等不利因素使其花青素含量和总黄酮含量均远远低于黑桑I，所以败果期桑椹利用价值普遍较低，可考虑由其自由脱落、腐烂，为土地增加养分；而盛果期桑椹在不同成熟阶段所含主要药用成分不同，可考虑批量采摘后，针对不同成熟阶段果实进行不同药用成分的选择性利用。这在经济育林、合理开发桑树价值方面有着重大意义。

4 结论

本文以果桑为研究对象，优化得出桑椹花青素的最佳提取工艺为液料比50∶1（mL/g）、提取液pH 3.0、乙醇浓度75%、超声时间30 min，提取率为1.72%。

对果桑、药桑、粉桑、黑桑I和黑桑II中的花青素与总黄酮含量进行提取和测定分析，结果显示花青素含量最高是果桑和黑桑I，粉桑、黑桑II和药桑次之；总黄酮含量最高的是果桑，其次是紫黑I、粉桑和药桑，最差是黑桑II。总体来看，果桑最佳，黑桑II的花青素与总黄酮含量均最低，利用价值较小。本研究响应了前人关于浆果在不同成熟期、贮藏环境中花青素与总黄酮含量的变化关系，其中，花青素含量在盛果期随果实成熟度及着色度的增加而增加，为桑椹的综合开发利用及桑树的进一步经济育林提供依据。