秋葵黄酮的纯化和体外抗氧化活性研究

周婧琦，罗双群，*，王晶晶，高愿军

（1.漯河食品职业学院，河南漯河462300；2.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南郑州450000）

黄秋葵是近年来在我国流行起来的一种高营养保健蔬菜，其果实口感柔滑，富含蛋白质和脂肪，可供炒、凉拌、煲汤，工业生产也可将其做成秋葵酱、罐头、腌菜等风味产品[1]。国内外研究表明，秋葵还具有抗疲劳、抗氧化、提高人体免疫能力等保健功效[2-4]。

黄酮类物质是一类含有酚羟基的还原性物质，酚羟基结构可提供质子和电子，与自由基反应，生成半醌式自由基[5]，从而中断自由基链式反应，不管是在生物体内或是体外均有很强的抗氧化性，秋葵具有的保健功效与其中所含有的黄酮类物质密切相关。为了从秋葵中提取纯度较高的黄酮类物质，分离纯化是关键步骤。目前黄酮类化合物的分离纯化方法主要有树脂吸附法、超滤法、层析法、金属试剂络合沉淀法等。而大孔吸附树脂优势突出，其吸附量大且被吸附物质易于洗脱，稳定性高，材料环保，可再生，能重复使用，但其在秋葵黄酮的分离纯化鲜有报道[6]，因此利用大孔树脂分离纯化秋葵黄酮具有重要价值。本文利用4种大孔树脂对秋葵黄酮进行分离纯化，确定最优纯化工艺条件，并通过体外抗氧化试验，测定秋葵黄酮的还原力及·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的清除能力，以期为天然抗氧化剂开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秋葵：郑州市纬三路蔬菜批发市场华玉蔬菜商行；大孔树脂 AB-8、NKA-9、HPD-400、D4020：郑州华溢科技新材股份有限公司；其余试剂均为分析纯。

XY-FD-18真空冷冻干燥机：上海欣谕仪器有限公司；RRHP-100型万能高速粉碎机：欧凯莱芙香港实业公司；SB-5200DT超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；WBFY-205微电脑微波化学反应器：巩义市予华仪器有限责任公司；HH-S4数显恒温水浴锅：金坛市医疗器械厂；HC-3618R高速冷冻离心机：安徽中科科学仪器有限公司；752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；HL-2恒流泵：上海青浦沪西仪器厂；DBS-100电脑全自动部份收集器：上海嘉鹏科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 秋葵黄酮粗样液的制备

挑选大小均匀的秋葵嫩荚，切2 mm薄片，真空冷冻干燥24 h，粉碎后过100目筛，然后以60%乙醇溶液为提取剂，采用超声微波联用法在微波功率550 W，液料比 1 ∶50（g/mL），超声 30 min，微波 60 s条件下提取秋葵中黄酮类化合物，提取后在8 500 r/min下离心5 min，将上清液在45℃下旋蒸浓缩得粗提物浸膏。

1.2.2 总黄酮含量测定

将芦丁标准品在108℃下烘干至恒重并精确称取10 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到100 μg/mL的芦丁标准溶液；再分别精确吸取芦丁标准液 0、2、4、8、10、16、20、25 mL 于标号 1～8 的 50 mL容量瓶中，分别加入5%NaNO2溶液1.5 mL，摇匀后静置6 min，再分别加入10%Al（NO3）3溶液1.5 mL，摇匀静置6 min，最后加入4%NaOH溶液20 mL，之后再用70%乙醇定容至刻度，摇匀静置15 min后510 nm下分别测定吸光值，以芦丁的质量浓度为X轴、吸光度为Y轴，绘制标准曲线；标准曲线的回归方程为：A=0.010 5c-0.002 0，R2=0.999 6。

1.2.3 大孔树脂的预先处理与装柱

按照所购买的树脂使用说明书对大孔树脂进行预处理，处理后将树脂湿法装柱，装柱规格为Φ1.5 cm×30 cm，装入树脂高度为15 cm。

1.2.4 静态吸附-解吸试验

1.2.4.1 大孔树脂型号筛选试验

准确称取预处理好的4种型号树脂各1 g于具塞锥形瓶，每个瓶中加入30 mL浓度为0.35 mg/mL的秋葵黄酮样液，于摇床内设定温度25℃，转速100 r/min，振荡12 h使树脂吸附饱和，测定剩余样液黄酮浓度C1，测后将吸附饱和的树脂过滤抽干，重置于100 mL锥形瓶中，加入70%乙醇30 mL，于摇床内在同样条件下振荡12 h，按1.2.2项下方法测定洗脱液中黄酮浓度Ce，计算吸附量、吸附率和解析率，每种大孔树脂做3个平行，取其平均值[7-8]。

式中：C0为初始加入的黄酮样液的浓度，mg/mL；C1为吸附平衡后样液中黄酮浓度，mg/mL；V1为初始加入的黄酮样液体积，mL；Ce为加入乙醇洗脱后乙醇中黄酮浓度，mg/mL；V2为加入乙醇体积，mL；M 为干树脂的吸附量，g。

1.2.4.2 静态吸附动力学试验

称取1.0 g预处理好的最佳吸附型号的树脂于具塞锥形瓶，加入浓度为0.35 mg/mL的秋葵黄酮样液40 mL，于摇床内25℃、100 r/min条件下振荡，每小时取0.5 mL溶液测定黄酮含量，计算大孔树脂吸附量。每种大孔树脂做3个平行，取其平均值，以时间为横坐标，树脂吸附量为纵坐标绘制静态吸附动力学曲线。

1.2.5 动态吸附-洗脱试验

1.2.5.1 上样浓度选择试验

将预处理过的AB-8树脂湿法装柱，用3种不同黄酮浓度（0.45、0.60、0.75 mg/mL）的样液上样，设定恒流泵流速0.7 mL/min，自动分部收集器每5 min收集一管流出液，测定每管流出液黄酮浓度，当流出液黄酮浓度C与初始黄酮浓度C0几乎相近时停止上样。

1.2.5.2 上样液流速选择试验

取浓度为0.55 mg/mL的秋葵黄酮样液上样，上样流速分别设定0.4、0.7、1.0 mL/min，自动分部收集器隔一定时间收集一管流出液，测定每管流出液黄酮浓度，当流出液黄酮浓度C与初始黄酮浓度C0几乎相近时停止上样。

1.2.5.3 洗脱剂浓度选择试验

取60 mL浓度为0.6 mg/mL的秋葵黄酮溶液按0.70 mL/min的流速过柱。过柱后用100 mL的乙醇洗脱，乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%，流速0.70 mL/min，设定自动分部收集器每5 mL收集一管，跟踪测定黄酮浓度，分别测定每管洗脱液的黄酮浓度，并计算每管中洗脱出的秋葵黄酮的质量，所有管相加即为该乙醇浓度洗脱下的总黄酮质量。最后以洗脱液体积为横坐标，以黄酮浓度为纵坐标绘制不同乙醇浓度的洗脱曲线。

1.2.5.4 洗脱流速选择试验

取60 mL浓度为0.6 mg/mL的秋葵黄酮溶液按0.70 mL/min的流速过柱。过柱后用100 mL70%乙醇洗脱，洗脱流速分别设定 0.4、0.7、1.0 mL/min，设定自动分部收集器每5 mL收集一管，跟踪测定黄酮浓度，分别测定每管洗脱液的黄酮浓度，并计算每管中洗脱出的秋葵黄酮的质量，所有管相加即为该流速所洗脱下的总黄酮质量。最后以洗脱液体积为横坐标，以黄酮浓度为纵坐标绘制不同洗脱流速的洗脱曲线。

1.2.6 秋葵黄酮体外抗氧化活性试验

以上述工艺纯化后的秋葵黄酮为原料进行体外抗氧化活性试验，还原力的测定采用铁氰化钾还原法[9]；·OH 清除率的测定采用邻二氮菲法[10]；O2-·清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法[10]；DPPH·清除率的测定采用DPPH法[11]；ABTS+·清除率的测定采用ABTS 法[6]。

1.2.7 半抑制浓度（half maximal（50%）inhibitory concentration，IC50）的计算

将黄秋葵黄酮的质量浓度对·OH、DPPH·、ABTS+·、O2-·的清除率作图并进行线性拟合。根据拟合的线性方程，当清除率为50%时所对应黄秋葵黄酮的质量浓度即IC50；以IC50值作为评价黄秋葵黄酮的抗氧化能力指标。

1.3 数据处理

数据均以均值±标准差表示，各组之间参数比较采用x2检验进行统计学分析。

2 结果分析

2.1 静态吸附-解吸试验

2.1.1 大孔树脂型号的选择

4种型号的树脂在相同的静态吸附条件下对秋葵黄酮的静态吸附量与解析率见表1。

表1 四种树脂的静态吸附试验Table 1 The static state absorption experiment of four kinds of resin

由表1可得，4种极性不同的大孔树脂，其中弱极性树脂AB-8对黄酮的吸附量最大，但是考率到解析率，则中等极性树脂HPD-400最大，因此拟通过后续试验综合考虑选择两者之一作为最佳吸附树脂。

2.1.2 AB-8和HPD-400树脂静态吸附动力学研究

AB-8与HPD-400的静态吸附动力学曲线如图1所示。

从图1可看出，AB-8树脂在静态吸附6 h时就已达吸附平衡，比HPD-400树脂快了2 h，因此，综合考虑静态吸附量与解析率以及树脂吸附平衡速率，对于秋葵黄酮物质的吸附，以吸附树脂类型为AB-8树脂为最佳。

图1 静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption kinetics curves

2.2 动态吸附-解吸试验

2.2.1 不同浓度上样液的泄漏曲线

不同上样浓度的泄漏曲线如图2所示。

图2 不同上样浓度泄露曲线Fig.2 The leaking curve of different sample concentration

从图2可以看出，上样液浓度越高，泄露点出现时间越早，上样浓度越低，泄露点出现时间越晚。上样液浓度0.75 mg/mL时，泄露点最早出现，因而造成样品有效成分过多泄漏，此外，由于上样浓度过大，对树脂造成了一定程度堵塞，从而既损失树脂又浪费样液。上样液浓度为0.45 mg/mL时，泄露点出现最晚，但上样效率过低，耗时过长，综合考虑应选择上样浓度0.60 mg/mL。

2.2.2 不同上样流速泄漏曲线

上样流速对吸附的影响主要是影响被吸附物质向树脂内部的扩散速率，若上样流速过快，则样液中待分离成分还未来得及与树脂充分接触便已经流出吸附柱，从而造成样液浪费；上样流速慢，则黄酮类物质与树脂接触时间长，分子能够充分扩散到树脂内，树脂床传质区间窄，从而可以增大吸附率，但流速过慢也使上样时间过久。实际生产中应综合考虑，既要使吸附率增大又需缩短生产时间提高生产效率。不同上样流速泄露曲线见图3。

从图3可以看出，上样流速为0.4 mL/min时耗时过久，流速为1.0 mL/min时泄漏过早，因此可选择0.70 mL/min流速作为最佳上样流速。

图3 不同上样流速泄露曲线Fig.3 The leaking curve of different sample flow rate

2.2.3 不同洗脱剂体积分数的洗脱曲线

由于AB-8树脂为弱极性树脂，因此选择极性溶剂洗脱其解析能力强，实际应用中因为乙醇无毒环保、价格低廉易回收，所以多选择乙醇作为极性树脂洗脱剂。而乙醇与水以不同比例混合，其极性发生变化，可对样液有效成分与AB-8树脂之间的分子作用力产生影响，且有效成分在不同浓度乙醇中的溶解度也不同，因此要通过动态洗脱试验进行最佳乙醇浓度的筛选，洗脱曲线如图4所示。

图4 不同浓度乙醇洗脱曲线Fig.4 The elution curve of different ethanol concentration

由图4可以看出，洗脱液浓度越高，峰值出现越早，80%乙醇洗脱峰型最宽，所以分离效果不好；70%乙醇洗脱峰型最尖锐，相比50%、60%浓度乙醇其分离效果良好；40%乙醇洗脱峰型出现过慢且扁平拖尾严重。综合考虑选择70%的乙醇浓度进行洗脱。

2.2.4 不同洗脱流速洗脱曲线

根据上一步试验所确定的最佳洗脱剂乙醇浓度，选择70%乙醇在不同流速下做洗脱曲线，洗脱曲线如图5。

由图5也可看出，洗脱流速越慢，峰型越尖锐集中，并且拖尾现象也越不明显，这是因为洗脱流速越小，洗脱剂能够越充分地进入树脂空隙，被吸附的物质越能充分接触溶剂从而被洗脱下来。计算不同流速下洗脱下来的总黄酮量，流速0.4 mL/min时，被洗脱的黄酮质量为28.32 mg，流速0.7 mL/min时，被洗脱下的黄酮质量为26.46 mg，流速为1.0 mL/min时，被洗脱下的黄酮质量为25.42 mg；因此不管从洗脱出峰尖锐程度还是被洗脱黄酮质量来看，选择洗脱流速为0.4 mL/min最佳。

图5 不同流速洗脱曲线Fig.5 The elution curve of different flow rate

2.2.5 AB-8大孔树脂纯化秋葵黄酮最佳动态吸附-洗脱条件验证

根据前面试验结果，取60mL浓度为0.60 mg/mL的秋葵黄酮样液按0.70 mL/min的流速上样，再用100 mL 70%乙醇以0.40 mL/min的流速洗脱，收集全部洗脱液，挥去一部分溶剂后将剩余洗脱液转移到一个干燥并称重过的培养皿中，将其冷冻干燥，干燥后立刻称重，差量法计算洗脱物质质量后再用100 mL70%乙醇复溶，测定其中黄酮含量，得到纯化后黄酮纯度达到67.3%，比纯化前高出28.1%。

2.3 秋葵黄酮的体外抗氧化性活性

秋葵黄酮的还原力及·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·清除率见图6。

图6 秋葵黄酮的还原力及·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·自由基清除率Fig.6 Reducing power and hydroxyl，superoxide anion，DPPH and ABTS+radical scavenging activities of okra flavonoids

由图6可以看出，在所考查的秋葵黄酮浓度范围内，秋葵黄酮与VC溶液的还原能力都随浓度增加而增强，且秋葵黄酮提取液的还原能力要优于VC溶液。秋葵黄酮对·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·均具有一定的清除能力，且清除能力随秋葵黄酮浓度的增加而增强，当秋葵黄酮浓度为1.0 mg/mL时，其最大清除率分别为90.4%、80.4%、77.6%、88.4%，具有良好的体外抗氧化活性。对秋葵黄酮的·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·清除率与浓度进行线性拟合，其线性拟合方程分别为：Y（·OH）=115.76X-15.227，R2=0.9557；Y（O2-·）=61.83X+23.873，R2=0.975 1；Y（DPPH·）=70.624X+6.087，R2=0.980 6；Y（ABTS+·）=80.364X+8.06，R2=0.992 7，均表现出良好的线性量效关系，从而可计算出秋葵黄酮的·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的 IC50值分别为 0.56、0.42、0.62、0.52 mg/mL。同理可得 VC的·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的 IC50值分别为 0.46、0.34、0.27、0.35 mg/mL，由此可知秋葵黄酮的抗氧化能力仅比VC略低，有很好的开发前景。

3 结论

通过大孔树脂静态吸附-解吸试验以及动态吸附-解吸试验对秋葵黄酮吸附分离的研究可知，AB-8型大孔树脂可作为纯化秋葵黄酮类物质的最佳吸附树脂，其纯化秋葵黄酮的最佳工艺为上样液浓度0.60 mg/mL，上样液流速0.70 mL/min，洗脱剂乙醇浓度为70%，洗脱流速为0.40 mL/min。最佳工艺纯化秋葵黄酮可使提取物黄酮纯度由39.2%提高到67.3%，说明AB-8树脂对秋葵黄酮具有良好的纯化效果且该纯化工艺可行。纯化后的秋葵黄酮的总还原力高于VC，对·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的IC50值分别为0.56、0.42、0.62、0.52，且浓度为1.0 mg/mL时，其最大清除率分别为90.4%、80.4%、77.6%、88.4%，具有良好的体外抗氧化活性。