食品中大肠埃希氏菌O121荧光PCR检测方法的研究

游淑珠，王小玉，蔡教英，姚丽锋，唐食明，冯家望，丁琦，符家忍

（珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东珠海519000）

大肠埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）俗称大肠杆菌，具有对极酸性环境耐受数小时的能力使之能够通过动物的胃进入肠道生存并繁殖，成为人和温血动物肠道中的正常栖居菌[1-2]。部分大肠埃希氏菌中能引起人类以腹泻症状为主的食源性疾病，统称为致泻大肠埃希氏菌（diarrheagenic E.coli，DEC）。DEC可分为6大类：肠道致病性大肠埃希氏菌（enteropathogenic E.coli，EPEC）、肠道侵袭性大肠埃希氏菌（enteroinvasive E.coli，EIEC）、产肠毒素大肠埃希氏菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC）、肠道集聚性大肠埃希氏菌（enteroaggregative E.coli，EAEC）、扩散附着大肠埃希氏菌（diffusely adherent E.coli，DAEC）和产志贺毒素大肠埃希氏菌为（shigatoxin-producing E.coli，STEC）。STEC 中部分菌株可在临床上引起人类出血性结肠炎或出血性腹泻，并可进一步发展为溶血性尿毒综合征，即为肠道出血性大肠埃希氏菌（enterohemorrhagic E.coli，EHEC），EHEC在世界上许多国家相继发生了暴发和流行，其流行已成为全球性的公共卫生问题之一[1]。

血清型是E.coli分类的最常用方法，E.coli血清型种类繁多，E.coli的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），其中 O 抗原是血清分型的基础，有一百七十多种[3]。目前发现的致泻大肠埃希氏菌与特定O抗原血清型有一定相关性，不同致泻大肠埃希氏菌的优势血清型不同，《伯杰氏系统细菌学手册》列出了已发现的EPEC、ETEC、EIEC、EAEC和STEC 5种致泻大肠埃希氏菌的相关血清型，E.coli O121 与 EIEC、STEC 相关[3-7]。

血清分型通过血清凝集试验实现，但由于血清交叉反应、菌体自凝集、菌体表面抗原干扰等影响，E.coli血清型种类繁多，加上分型用血清售价较高、保质期短，使得传统血清分型检测费用居高不下，准确度、检出率、灵敏度不尽如人意，在实际应用中大大受限。随着以PCR技术为代表的现代分子生物学技术的发展，E.coli O抗原基因簇基因序列的公布，分子生物学检测方法逐渐被成功应用于E.coli多种血清型的检测，弥补了传统血清分型的不足，实现了E.coli O抗原血清型的快速、准确、高效检测。其在应对食品安全重大爆发事件中其优势充分体现，如2011年5月-7月德国发生的EHEC O104：H4感染暴发疫情，波及部分欧洲其他国家及美国、加拿大等国家，HUS报告病例数表明，这也是迄今为止全球范围内规模最大的EHEC食源性疾病暴发事件[8]，当时德国负责疾病防控与公众健康的权威机构——罗伯特·科赫研究所（Robert Koch Institute，RKI）和我国疾病预防控制中心应对这一紧急事件均应用了PCR检测技术[9-10]。E.coli O121血清型的PCR检测方法也有相关报道[7，11-13]。

荧光PCR技术特异性好、灵敏度高，操作简便、自动化程度高，可全程动态监控整个PCR反应过程，检测结果在扩增反应过程中实时可见，不需电泳和凝胶成像步骤、检测时间短，正以其无可取代的优势被广泛用于微生物检测领域，二十一世纪以来被逐步推广应用生物学研究、食品检测、环境检测、医学检测与诊断等行业[14]。

本研究以E.coli O121为检测对象针对其O抗原基因簇的vioA基因建立了其血清型特异性荧光PCR检测方法。通过对所建方法的灵敏度、特异性进行验证，确定了所建方法对食品中E.coli O121快速检测的适用性和可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

E.coli O121（菌种编号：ATCC BAA-2190）、E.coli O26（菌种编号：ATCC 12795）、E.coli O45（菌种编号：ATCC BAA-2469）、E.coli O103 （菌种编号：ATCC 23982）、E.coli O111 （菌种编号：ATCC 43887、ATCC 29552、ATCC 33780）、E.coli O145 （菌种编号：ATCC BAA-2216）、E.coli（菌种编号：ATCC 700078、ATCC 10798、ATCC 13706、ATCC 15597、ATCC 11229）：美国典型菌种保藏中心；E.coli O8（菌种编号：ETEC O8）、E.coli O78（菌种编号：ATCC 35401）、E.coli O78（菌种编 号 ：ETEC O78）、E.coli O124 （菌种编号：ATCC 43893）：黑龙江检验检疫局提供；E.coli O4（菌种编号：EC O4）、E.coli O104（菌种编号：EC O104）：珠海出入境检验检疫局保健中心提供；E.coli O157（菌种编号：CCTCC AB 200051）、E.coli（菌种编号：CCTCC AB 200068）、肠炎沙门氏菌（菌种编号：CCTCC AB 94018）、金黄色葡萄球菌（菌种编号：CCTCC AB 91053）、铜绿假单孢菌（菌种编号：CCTCC AB 91095）、单核细胞增生李斯特氏菌（菌种编号：CCTCC AB 97021）：中国典型培养物保藏中心；E.coli O157（菌种编号：NCTC 12900）、E.coli（菌 种编号：CMCC（B）44102）、金黄色葡萄球菌（菌种编号：CMCC（B）26003）、表皮葡萄球菌（菌种编号：CMCC（B）26069）、藤黄微球菌（菌种编号：CMCC（B）28001）、阪崎肠杆菌（菌种编号：ATCC 51329）、副溶血性弧菌（菌种编号：ATCC 17802）、乙型溶血性链球菌（菌种编号：CMCC（B）32210）、枯草芽孢杆菌（菌种编号：CMCC（B）63501）、粪肠球菌（菌种编号：CMCC（B）32220）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（菌种编号：CMCC（B）52204）、变形杆菌（菌种编号：CMCC（B）49027）、肺炎克雷伯氏菌（菌种编号：CMCC（B）46101）、福氏志贺氏菌（菌种编号：CMCC（B）51571）、宋内氏志贺氏菌（菌种编号：CMCC（B）51334）：广东环凯微生物科技有限公司；空肠弯曲菌（菌种编号：ATCC 33291）：美国 Microbiologics公司；嗜酸乳杆菌（菌种编号：CGMCC 1.1878）：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1.1.2 培养基、试剂与溶液

EC肉汤：北京陆桥技术有限公司；Premix Ex Taq（Probe qPCR）试剂盒、DNA Marker：日本 TAKARA 公司；DNA提取试剂盒（离子柱型）DP 302：北京天根生化科技有限公司；DNA裂解液：珠海科登生物工程有限公司。

1.1.3 引物、探针

在www.ncbi.nlm.nlh.gov网站上检索的来源不同的E.coli O121的O抗原基因簇序列（GenBank序列号 ：AY208937、JN859209-JN859220），DNAMAN 软 件比对，根据vioA基因高保守区的基因序列，利用Oligo7.0软件设计引物、探针。上游引物：5’-ATCCGAGAAGAATTGAAGA-3’、下游引物：5’-CATG －GAAACTTAAGACACTTA-3’、探针：5’-JOE-AACACTTCCATCATCATCTTCAACG C-TAMRA-3’，均委托上海Invitrogen公司合成。引物对和探针分别用无菌超纯水稀释到储备浓度100 μmol/L，-20℃保存，临用时无菌超纯水稀释至10 μmol/L。

1.1.4 样品

畜肉196份：市场上采购；水产品46份、禽产品43份、可生食蔬菜54份：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心受理的委托检验样品。

1.2 仪器与设备

核酸浓度测定仪（ND-1000）：美国NanoDrop公司；离心机（Minispin Plus）：德国 Eppendorf公司；荧光PCR仪（7500Fast）：美国ABI公司；拍击式均质器（AES Smasher）：法国Biomerieux公司；恒温培养箱（1565-2E）：美国SHELLAB公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌DNA模板的提取、浓度及纯度的测定

指数期生长各菌株菌液，用DNA提取试剂盒并按其说明提取制备DNA模板。使用核酸浓度测定仪测定出DNA的浓度，OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适用于PCR扩增。

1.3.2 荧光PCR反应体系和反应条件

反应体系：体积为 25 μL；2× Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5μL、引物对（10μmol/L）1μL、探针（10μmol/L）1 μL、50×ROX Reference Dye II 0.5 μL、模板 2 μL、无菌超纯水 8 μL。

反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性15 s，60℃退火30 s，收集荧光，40个循环。

1.3.3 荧光PCR特异性试验

用DNA提取试剂盒分别提取各菌株的DNA模板，按上述条件进行荧光PCR扩增，验证荧光PCR方法的特异性。

1.3.4 荧光PCR灵敏度试验

将提取的E.coli O121的DNA进行10倍连续递增稀释至10-7浓度，将原液和各DNA核酸稀释液分别用相同条件进行荧光PCR扩增，确定荧光PCR方法的灵敏度。

1.3.5 食品样品的检测

1.3.5.1 制样

无菌称取样品25 g至带滤网拍击式均质袋加入225 mL EC肉汤，拍击式均质器均质2 min。

1.3.5.2 增菌

样品均质后于恒温培养箱36℃培养24 h。

1.3.5.3 核酸提取

培养结束后，取带滤网拍击式均质袋中培养物滤过液按热裂解法提取核酸：1 mL培养物滤过液于1.5 mL离心管12 000 r/min离心5 min，弃上清，加DNA裂解液50 μL，于100℃金属浴裂解5 min，冷却后12 000 r/min离心5 min，上清备用。

1.3.5.4 荧光PCR检测

按1.3.2中的条件进行荧光PCR检测。

1.3.5.5 结果判定

根据荧光PCR仪给出的样品到达域值水平所经历的循环数（即Ct值）进行样品结果判定。Ct值≤35时，判定检品E.coli O121阳性；Ct值为零或≥37时，判定E.coli O121阴性。Ct值介于35～37之间判断为可疑，采用5 μL模板量进行重复试验，如出现指数期明显的扩增曲线可判定为阳性，否则为阴性。

2 结果与分析

2.1 E.coli O121荧光PCR方法的建立

E.coli O121荧光PCR扩增曲线见图1。

以E.coli O121的O抗原基因簇的vioA基因为靶基因，设计引物、探针，经反应体系优化，建立了E.coli O121荧光PCR检测方法，E.coli O121标准菌株呈现出典型的荧光PCR扩增曲线，表明该荧光PCR反应体系适用于E.coli O121的检测。

图1 E.coli O121荧光PCR扩增曲线Fig.1 Amplification plot of the real-time PCR method for detection of E.coli O121

图2 E.coli O121荧光PCR特异性试验扩增曲线Fig.2 Amplification plot of specificity test of the real-time PCR method for detection of E.coli O121

2.2 E.coli O121荧光PCR方法特异性试验

E.coliO121荧光PCR特异性试验扩增曲线见图2。

取1.1.1中所列的E.coli菌株的以及其他菌株的DNA进行实时荧光PCR扩增。结果表明，仅E.coli O121扩增出阳性增幅曲线，其它非O121 E.coli和非E.coli菌株DNA样本的检测结果均为阴性。据此可判断，本研究设计的E.coli O121检测引物和探针具有很好的特异性。

2.3 E.coli O121荧光PCR方法灵敏度试验

E.coli O121菌株的DNA经核酸浓度测定仪测得其浓度为31 ng/μL，菌株DNA原液和7个连续10倍梯度的DNA稀释液各2 μL用于扩增，E.coli基因组大小为0.004 pg/拷贝，菌株DNA原液模板相当于15 500 000拷贝，菌株DNA原液和7个连续10倍连续递增稀释的稀释液检测灵敏度试验扩增曲线见图3。

由图3可知，本方法的检测灵敏度可达155拷贝/反应。

2.4 食品样品检测

所检的339份食品样品中检出E.coli O121阳性9份，阳性率2.7%，样品检测结果见表1。

表1 食品样品污染调查结果统计分析Table 1 Statistics analysis of food samples pollution survey

结合样品来源分析，196份畜肉均为市场上采购获得的生猪肉和生牛肉，未经过食品深加工，检出样品E.coli O121阳性8份，阳性率4.1%；水产品、禽产品、可生食蔬菜均为本单位受理的委托检验样品，多数为经过加工的产品，特别是部分水产品和禽产品为深度加工的鲜、冻产品，阳性率较低，46份水产品检出样品E.coli O121阳性1份，阳性率2.1%；禽产品43份和可生食蔬菜54份的E.coli O121检测结果均为阴性。检测结果预示样品检测阳性率与食品基质和加工程度存在一定相关性，食品基质营养越丰富、未经过加工或只经过初加工的产品阳性率相对较高。

3 讨论

随着现代分子生物学技术的发展，以PCR技术为代表的现代分子生物学技术以其特有的快速、准确、高效等优势被广泛应用于分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等领域。我国2016版12月发布并于2017年6月实施的2016版GB 4789系列食品安全国家标准中致泻大肠埃希氏菌（GB 4789.6-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》）、肉毒梭菌（GB 4789.12-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》）、诺如病毒（GB 4789.42-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》）3项食品微生物学检验指标也首次将PCR技术纳入强制性国家标准方法[4，15-16]，使得标准的科学性、实用性更强。

E.coli O121是重要的致泻大肠埃希氏菌血清型之一，与致泻大肠埃希氏菌中EIEC、STEC两类相关[3-7]。开展E.coli相关血清型的分子生物学检测方法的研究可有效弥补传统血清分型的不足，可实现E.coli O抗原血清型的快速、准确、高效检测，尤其利于应对食品安全紧急突发事件，意义重大。GB 4789.6-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》给出了致泻大肠埃希氏菌相关毒力基因的PCR检测方法，但血清学试验仍采用传统血清凝集进行，E.coli O抗原血清型分子生物学检测方法的研究可提供一个良好补充。

本研究选择E.coli O121的O抗原基因簇的vioA基因的特异性序列为靶序列，进行E.coli O121的实时PCR快速检测方法研究。根据BLAST分析结果，所选定的引物、探针序列均与GenBank中的所有E.coli O121对应基因序列完全吻合，而与其他基因序列无明显相关性。建立的荧光PCR方法对包括E.coli O121在内的23株E.coli细菌和19株非E.coli细菌进行检测，结果显示，其中E.coli O121菌株检测为阳性，而其他细菌检测为阴性，说明引物和探针具有高度特异性。上述引物序列分析以及特异性试验结果说明所建立的荧光PCR方法适用于E.coli O121的快速检测。为确定该方法检测灵敏度，对已知浓度E.coli O121的提取每个稀释度细菌基因组DNA进行10倍梯度稀释后进行实时荧光PCR检测，结果显示，原始菌液稀释至10-5时仍能检出，表明本检测方法对E.coli O121的检测灵敏度可达0.62 pg/反应，即155拷贝/反应。

本研究建立的食品中E.coli O121荧光PCR检测方法用于全程（包括样品前增菌、核酸提取、荧光PCR扩增反应）仅需约1.5 d，直接检测样品增菌液可在2 h内完成，从上机到得到检测结果可在1 h内完成，与传统细菌分离鉴定方法比较显著缩短检测时间。

通过对方法特异性、灵敏度和实际样品污染的调查证实，本研究建立的荧光PCR快速检测方法操作简便、快速、特异性强、灵敏度高，缩短检测周期，可用于食品中E.coli O121的快速检测。