杨梅功能活性成分的UPLC-ESI-Q-TOF/MS分析

薛莹，徐先顺，雍莉，林奕希，周银颖，谢静，*

（1.四川省疾病预防控制中心，四川成都610041；2.成都医学院四川养老与老年健康协同创新中心，四川成都610083；3.成都医学院药学院，四川成都610083）

杨梅（Myrica rubra（Lour.）S.et Zucc.，英文名Waxberry），原产我国浙江余姚，目前主产区为江南地区，在湖南、广东、广西、贵州等多个省市也有分布。杨梅是我国传统的特产水果，富含花青素及其糖苷、黄酮及其糖苷和酚酸等成分[1-4]，不但营养价值丰富，还具有增强免疫力、调整肠胃功能、降血糖、降血脂、抗衰老、抗突变、抗肿瘤和增加血小板数量等功效[5]。国内外对杨梅化合物成分研究都仅仅是分别对某几个化合物进行了分析，尚未进行杨梅中功能活性成分的全面检测。

电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），作为一种软电离的质谱离子源，可以产生较多的分子离子碎片，有助于化合物结构的解析，已广泛应用于天然产物的结构鉴定研究[6-11]。在多种质量分析器中，飞行时间质谱（TOF/MS）具有高质量精度、高灵敏度、高分辨率等优点，可测定复杂基质中化合物的精确质量数，从而实现化合物的定性确认。同时TOF/MS还具有高扫描速度的优势，使得其对检测化合物的数量几乎无限制，从而实现大量化合物的同时筛查。利用色谱的分离能力，通过化合物的精确质量数与保留时间数据，并结合二级碎片分析，可实现同分异构体鉴定，因此，LC-TOF/MS已被广泛应用于食品中化学成分[12]、农药残留[13]、兽药残留[14]等的筛查与确证中。为了全面确定杨梅中所含功能活性成分的情况，为后续研究打下基础，本课题充分结合利用UPLC快速分离和Q-TOF/MS准确定性优势，结合参考文献，对杨梅中的小分子活性化合物进行了UPLC-ESI-Q-TOF/MS定性筛查。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

JP-020超声波清洗器：深圳市洁盟清洗设备有限公司；GA110分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；移液器：大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；Heidolph匀浆机：德国SilentCrusher公司；Milli-Q型超纯水仪：美国MILLIPORE公司；0.22 μm滤膜：上海安谱实验科技有限公司；含SIL-30AC自动进样器、LC-30AD泵和CTO-30A柱温箱的岛津超高效液相色谱：日本岛津株式会社；TripleTOFR4600四级杆/飞行时间质谱：美国AB Sciex公司；其它试剂均为分析纯：成都市科龙化工试剂厂；杨梅样品：市售。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为AgilentZORBAXSB-Aq（3.0mm×100mm，1.8 μm）。流动相为0.1%甲酸水溶液（A相）、乙腈（B相），流速为 0.3 mL/min，梯度洗脱：0～5 min保持 5%B，5 min～30 min从 5%B 线性上升至 20%B，30 min～40 min从20%B线性上升至70%B，40 min～41 min从70%B线性上升至90%B，41 min～45 min保持90%B，45 min～46 min从 90%B 线性下降至 5%B，46 min～50 min保持5%B；柱温为35℃。精密吸取对照品溶液2 μL，注入超高效液相色谱仪，测定。

1.2.2 质谱条件

电喷雾电离正离子模式仪器参数：毛细管电压为5 000 V，雾化气为345 kPa，辅助气为345 kPa，气帘气为241 kPa，雾化温度为500℃，去簇电压为80 V，碰撞能为10 eV，全扫描质核比范围为m/z 100～1 000，并采用APCI Positive Calibration Solution对仪器质量精度进行实时校正。

电喷雾电离负离子模式仪器参数：毛细管电压为-4 500 V，雾化气为345 kPa，辅助气为345 kPa，气帘气为241 kPa，雾化温度为500℃，去簇电压为-80 V，碰撞能为10 eV，全扫描质核比范围为m/z 100～1 000，并采用APCI Positive Calibration Solution对仪器质量精度进行实时校正。

1.2.3 样品前处理

将新鲜的杨梅果肉和果核分离后，果肉放入匀浆机中匀浆，然后精密称取1 g匀浆后的样品，至25 mL容量瓶中，加含1%三氟乙酸的甲醇20 mL超声提取20 min，静置冷却至室温后，用含1%三氟乙酸的甲醇定容至25 mL，摇匀，用0.22 μm的有机相滤膜过滤，即得待测样品。

1.2.4 筛查方法

首先，基于杨梅属植物和常见水果（如草莓、葡萄）中小分子化合物的已有文献，建立一个含有100余种相关化合物的“待筛查化合物数据表”。然后在TOF/MS全扫描模式下测定杨梅样品，通过检测到的各成分的精确质量，运用上述“待筛查化合物数据表”进行检索，找出可能的化合物。最后在Targeted MS/MS采集模式下进行化合物的二级质谱分析，确证相应化合物的结构。对于同分异构体，再根据色谱保留时间（出峰先后顺序），参考文献报道予以确定，如许多对同分异构体，其差别仅仅在于糖基，一个是半乳糖基，一个是葡萄糖基，前者出峰较前，后者出峰较后。

2 结果与分析

2.1 分析条件的选择

本试验比较乙腈（甲醇）-水（酸性水溶液）构成的多种溶剂洗脱系统，结果表明乙腈系统中化合物的理论塔板数更高，而酸性水溶液也可提高峰的对称性[15]，因此最终采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为洗脱流动相。由于本试验待测化合物较多，紫外吸收复杂，在不同的吸收波长下图谱差异很大，图谱不易解读，故未进行紫外检测，而直接采用TOF/MS全扫描检测；虽然化合物未实现基线分离，但由于质谱具有分子量提取功能，只需确保UPLC将同分异构体分离开即可。本试验还考察了不同的流速（0.2、0.3、0.4 mL/min）和不同的柱温（25、30、35、40℃）等条件组合，结果表明，流速和柱温对化合物出峰时间及峰形、分离度影响不大。综合上述筛选，确定分析条件，杨梅样品的UPLCESI-TOF/MS全扫描总离子流图如图1所示。

图1 杨梅样品的UPLC-TOF/MS全扫描总离子流图Fig.1 The total ion current（TIC）chromatogram of Chinese waxberry by UPLC-TOF/MS

2.2 筛查结果

除了花青素类化合物，本身是正离子状态，采用正离子扫描模式进行检测外，其余化合物均采用正负离子同时扫描，互为对照。同时在配合二级离子碎裂，从而避免假阳性结果的产生，提高筛查的准确性。采用1.2.4所述的筛查方法，共从杨梅中筛查出28个功能活性成分，归纳整理于表1，其中包括13个黄酮及其糖苷（化合物1～13）、6个花青素及其糖苷（化合物14～19）和 9个酚类化合物（化合物 20～28）。

杨梅中含有大量的黄酮苷和花青素苷，并出现了一些同分异构体，这些异构体的苷元相同，其差别仅仅在于糖基，一个是半乳糖基，一个是葡萄糖基。虽然无论是高分辨的精确质量数还是二级碎裂特征，都无法区分它们，但是，可以通过色谱保留时间先后顺序进行区分。在前期的研究中发现，如果是同样苷元的同分异构体糖苷，半乳糖基取代的苷出峰较前，葡萄糖基取代的苷出峰则较后[10]。据此，对杨梅中的几对同分异构体进行了结构确认。杨梅中含有的功能活性成分见表1。

表1 杨梅中含有的功能活性成分Table 1 The active ingredients detected in Chinese waxberry

2.3 黄酮糖苷和花青素糖苷的质谱裂解规律探讨

从表1结果可知，黄酮糖苷和花青素糖苷是杨梅功能活性成分中最多的两大类化合物，占比约为67%。本研究中发现黄酮苷元共3种，分别是槲皮素、山奈酚和杨梅素；花青素苷元共4种，分别是飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素和芍药花色素，其结构如图2所示。

续表1 杨梅中含有的功能活性成分Continue table 1 The active ingredients detected in Chinese waxberry

图2 黄酮苷元和花青素苷元的结构Fig.2 Chemical structures of flavone aglycone and anthocyanin aglycone

2.3.1 黄酮苷的质谱裂解规律

除3个黄酮苷元外，本研究共筛查出10个黄酮苷类化合物，其二级质谱将首先丢失糖基碎片，黄酮苷在丢失糖基的过程中，会同时产生均裂和异裂两种断裂方式。杨梅中的黄酮苷均是3-O糖基取代，3-O糖基取代的黄酮苷一个重要二级质谱裂解特征是均裂碎片丰度大于异裂碎片丰度。以化合物5（杨梅苷，杨梅素-3-O-鼠李糖苷）为例：如图3 A所示，在负离子模式下全扫描，化合物5的分子离子峰是m/z 463[MH]-；图3 B为二级碎裂图谱，可见化合物的分子离子峰m/z 463[M-H]-丢失鼠李糖基碎片后，分别产生一个均裂碎片峰m/z 316（[Yo-H]-·）和一个异裂碎片峰m/z 317（Yo-），但 m/z 316 的丰度明显大于 m/z 317；进一步，m/z 316还产生了典型的m/z 287[Y0-H-CO-H]－碎片峰和m/z 271[Y0-H-CO-OH]－碎片峰。这一结果与文献所报道的3-O糖基取代黄酮苷裂解规律完全一致[16-17]。杨梅素-3-O-鼠李糖苷的质谱碎裂图及裂解示意图如图3所示。

图3 杨梅素-3-O-鼠李糖苷的MS图、MS2图和裂解示意图Fig.3 Typical negative ion mass spectra of myricitrin（full scan；MS2），and proposed fragmentation pathway of myricitrin

2.3.2 花青素苷的质谱裂解规律

花青素是酚类化合物中的类黄酮类，为水溶性色素，广泛存在于植物花瓣、果实的组织中及茎叶的表面细胞与下表皮层。在自然状态下，花青素在植物体内常与各种单糖结合形成糖苷，形成花青素苷。花青素苷类化合物本身带正电荷，因此负离子扫描不出峰。在ESI离子源质谱碎裂时，首先将得到一个丢失糖的碎片峰，以化合物16（芍药花色素-3-O-葡萄糖苷）为例说明：在正离子模式下全扫描，化合物16的分子离子峰是m/z 463[M]+（图4 A），分子离子峰m/z 463[M]+丢失葡萄糖后，产生一个丢失162碎片MS2峰m/z 301[M-glc]+，由于芍药花色素苷元具有3’-OCH3结构，因此还同时产生了进一步丢失CH3碎片的碎片峰m/z 286[M-glc-CH3]+（图4 B）。芍药花色素-3-O-葡萄糖苷的MS图、MS2图谱及其裂解机理如图4所示。

图4 芍药花色素-3-O-葡萄糖苷的MS图、MS2图和裂解示意图Fig.4 Typical positive ion mass spectra of petunidin-3-O-glucoside（full scan；MS2），and proposed fragmentation pathway of petunidin-3-O-glucoside

3 结论

本研究建立无需标准品对照快速筛查杨梅中功能活性成分的超高效液相色谱－四级杆/飞行时间质谱（UPLC-ESI-Q-TOF/MS）检测方法，全面研究杨梅中的活性成分种类。运用该方法灵敏、快速、准确地从市售杨梅样品中共鉴定出28个功能活性成分，其中包括13个黄酮及其糖苷、6个花青素糖苷和9个酚类化合物；同时，本研究还对杨梅中的黄酮苷和花青素苷的质谱裂解规律进行探讨，进一步对化合物的结构进行确证。通过此项工作，对全面筛查杨梅中可能含有的活性化合物种类，为基于杨梅的功能食品和保健食品开发打下了坚实的基础。