四川不同产地厚朴HPLC指纹图谱及含量测定研究

任波，董佳悦，安太勇，刘美琳，张梅

（成都中医药大学中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）

厚朴来源于木兰科植物厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）或凹叶厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮。收载于2015年版《中国药典》一部，具有燥湿消痰、下气除满的功效[1]，临床上主要应用于治疗抑郁症、肠梗阻、慢性肝炎、缓解更年期症状等病症[2-4]。现代化学研究表明厚朴中主要化学成分包括木脂素、挥发油及生物碱类等。药理研究表明厚朴具有抑菌、抗肿瘤、促进胃肠蠕动等作用[5-6]。四川作为厚朴的道地产区与主要产区之一，川内厚朴种质资源遍布了都江堰市、乐山市（沐川、马边等）、阿坝州（松潘、汶川、茂县等）、雅安、峨眉山市等多个产地。据报道不同品种、不同产地间的厚朴化学成分组成及含量差异显著[7-8]。而且同一厚朴中不同类型化学成分相差较大，其中厚朴酚、和厚朴酚成分居首要地位，远远高于紫丁香苷、木兰花碱等成分，运用单波长检测方法不能全面体现厚朴药材的整体信息。因此本文采用多波长切换技术方法[9-11]，对四川42个不同产地厚朴（二十年树龄左右）建立高效液相色谱法（high efficiency liquid chromatography，HPLC）指纹图谱，同时测定药材中厚朴酚、和厚朴酚的含量，以期寻找四川不同产地间厚朴化学成分及含量的异同，为全面控制和评价四川木兰科植物厚朴的质量提供合理依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（包括Agilent 1200四元泵、Agilent 1200色谱工作站、DAD检测器）：美国Agilent公司；BSA224S型电子分析天平、BP211D型电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；2004A版中药色谱指纹图谱相似度评价系统：国家药典委员会；KQ－500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.2 样品及试剂

厚朴酚（Magnolol，MUST－14072405）、和厚朴酚（Honokiol，MUST－14092818）、木兰花碱（magnoflorine，MUST-14122416）、紫丁香苷（syringin，MUST-15021504）对照品，纯度均≥98%：成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈为色谱纯：美国Fisher公司；其他试剂均为分析纯：成都市科龙化工试剂厂；纯净水（Milli－Q纯水制备系统制备，0.45 μm滤膜滤过）。

1.3 药材

42份厚朴样品分别从四川都江堰、峨眉山、乐山、雅安及眉山等地收集，经成都中医药大学中药资源与鉴定系裴瑾教授鉴定，所有样品均为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils的干燥干皮、根皮及枝皮。厚朴药材来源见表1。

表1 厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）药材来源Table 1 Magnolia（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）officinalis source

续表1 厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）药材来源Continue table 1 Magnolia（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）officinalis source

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：InertSustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱 0～5 min，5%A；5 min～20 min，5%～20%A；20 min～30 min，20%～70%A；30 min～50 min，70%～90%A；50 min～60 min，90%～5%A；体积流量 0.8 mL/min；柱温 35 ℃，进样量 20 μL，检测波长：265 nm（0～31 min，木兰花碱、紫丁香苷）、294 nm（31 min～60 min，厚朴酚、和厚朴酚）。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取对照品厚朴酚、和厚朴酚，紫丁香苷、木兰花碱适量，加70%的甲醇配制成厚朴酚1.560 g/L、和厚朴酚2.000 g/L、紫丁香苷1.530 g/L、木兰花碱1.295 g/L对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液2.5、0.5、0.5、1 mL 置于 5 mL 容量瓶中，加 70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取厚朴粉末（过三号筛）1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，称重，密封，超声辅助提取40 min，放冷，称重，加70%甲醇补足减失的重量，摇匀，即得。

2.4 四川不同产地厚朴高效液相色谱法指纹图谱的建立

2.4.1 精密度试验

取供试品粉末（S36），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，连续进样6次。结果表明，各共有峰的相对保留时间、相对峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.05%～1.13%，0.43%～2.95%，均小于3%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱测定相关要求。

2.4.2 重复性试验

取同一批供试品粉末（S36），平行6份。按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样检测，测定HPLC图谱。计算其各共有峰的相对保留时间、相对峰面的RSD分别为0.03%～1.21%，1.90%～2.69%，均小于3%，表明重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液（S36），按“2.1”项下色谱条件在0、2、4、8、16、24h 分别进样行 HPLC 分析。结果表明，各共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD分别为0.05%～2.35%，1.25%～2.58%，均小于3%，表明24 h内其稳定性良好。

2.4.4 四川不同产地厚朴HPLC指纹图谱的建立

精密称取42批厚朴粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样检测，记录色谱图，以峰面积大于总峰面积的2%为限度，选取色谱峰作为指纹特征峰。共选取9个共有峰，通过与对照品比对，在265 nm下，指认了2个共有峰，分别为紫丁香苷（1号峰）、木兰花碱（5号峰）；294 nm时，标记了2个共有峰，分别为和厚朴酚（8号峰）、厚朴酚（9号峰）。其结果见图1、图2、图3。

2.4.5 相似度评价

采用药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A）软件，将42批四川不同产地厚朴药材HPLC指纹图谱数据导入分析，见表2。

得到其指纹图谱与对照指纹图谱之间相似度为0.868～0.990，其中都江堰龙池镇虹口景区观风沟和峨眉山市符溪镇丰收村相似度较低，分别为0.884和0.868；其余产地厚朴样品的相似度均在0.9以上，说明四川不同产地间厚朴药材差异较小。

图1 混合对照品HPLC指纹图谱Fig.1 Chromatograms of mixed reference solution

图2 供试品溶液HPLC指纹图谱Fig.2 Sample solution of Magnolia officinalis

图3 42批样品溶液HPLC指纹图谱Fig.3 HPLC matched chromatograms for 42 batches of Magnolia officinalis

表2 42批四川不同产地厚朴多波长切换对照指纹图相似度Table 2 Similarity results table of reference fingerprint at different batches of Magnolia officinalis

续表2 42批四川不同产地厚朴多波长切换对照指纹图相似度Continue table 2 Similarity results table of reference fingerprint at different batches of Magnolia officinalis

2.4.6 指纹图谱聚类分析

选取42个四川不同产地厚朴多波长切换指纹图谱4个共有峰相对峰面积为变量，得到42×4阶原始数据矩阵，运用SPSS 19.0软件，采用中位数聚类法，以夹角余弦为样品相似度的距离公式对药材进行系统聚类分析，聚类分析结果见图3。

由图3可知，四川不同产地厚朴药材被分为三大类，第一类包括：S1；第二类包括：S5；第三类包括：S2、S3、S4、S5、S6、S7、7S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、S22、S23、S24、S25、S26、S27、S28、S29、S30、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37、S38、S39、S40、S41、S42。通过聚类分析发现，四川各产地厚朴药材之间的相关性与相似度分析结果较为一致。

图3 42批厚朴样品聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis for 42 batches of Magnolia officinalis

2.5 厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的含量测定

2.5.1 精密度考察

精密吸取同一供试品溶液（S36），按“2.1”项下色谱条件进样检测，连续进样6次。厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD分别为1.58%，1.41%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性考察

取同一批供试品粉末（S36），平行6份。按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样检测，测定HPLC图谱。厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD分别为1.86%、0.03%，均小于3%，表明重复性良好。

2.5.3 稳定性考察

精密吸取同一供试品溶液（S36），按“2.1”项下色谱条件在 0、2、4、8、16、24 h 分别进样行 HPLC 分析。厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD分别为1.96%、2.34%，均小于3%，表明24 h内稳定性良好。

2.5.4 线性关系考察

分别将2.2项下的厚朴酚、和厚朴酚的对照品溶液，用70%的甲醇逐级稀释，得到厚朴酚质量浓度分别为 1.560、1.365、1.170、0.585、0.390、0.195 g/L；和厚朴酚质量浓度分别为 1.000、0.800、0.400、0.100、0.050、0.025 g/L的系列混合对照品溶液；分别吸取20 μL注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件依次进样检测。以质量浓度（X，g/L）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得回归方程。厚朴酚的回归方程为Y=35.742X-715.94（r=0.999 9），在0.195 g/L～1.560 g/L范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系；和厚朴酚的回归方程为Y=41.821X+70.081（r=0.999 3），在0.025 g/L～1.000 g/L范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5.5 加样回收率试验

称取厚朴样品（S36）6份，每份0.1 g，精密称定。分别精密加入与样品中厚朴酚、和厚朴酚含量相当的厚朴酚3.12 mg、和厚朴酚0.8 mg对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算平均回收率。结果厚朴酚、和厚朴酚的平均回收率分别为97.17%，96.41%；RSD分别为2.98%、2.56%。表明该方法准确度良好。

2.5.6 样品的测定

取42批四川不同产地厚朴粉末1 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，结果见表3。

2.5.7 样品测定结果分析

采用HPLC波长切换方法对42个四川不同产地的厚朴进行了定量测定，见表4。

表3 不同产地厚朴中厚朴酚、和厚朴酚含量测定结果Table 3 Determination of magnolol and honokiol in Magnolia officinalis from different habitats

续表3 不同产地厚朴中厚朴酚、和厚朴酚含量测定结果Continue table 3 Determination of magnolol and honokiol in Magnolia officinalis from different habitats

表4 厚朴酚、和厚朴酚含量药典方法测定结果Table 4 Determination of magnolol and honokiol in Magnolia officinalis by the pharmacopoeia method

厚朴酚含量为8.56 mg/g～36.41 mg/g，和厚朴酚含量为5.29 mg/g～29.17 mg/g。厚朴酚、和厚朴酚总含量范围分别为14.36 mg/g～65.58 mg/g，其中除峨眉山市丰收村、茶地村、乐山市刘沟村、麻柳乡及阿坝州的厚朴中厚朴酚、和厚朴酚总含量较低外，其他产地中厚朴酚、和厚朴酚总含量均大于2.0%，符合药典要求。同时参照《中国药典》（2015年版）厚朴含量测定方法对S1样品进行测定，结果药典方法所测样品中厚朴酚、和厚朴酚总含量与试验中建立的HPLC方法测定厚朴酚、和厚朴酚结果基本一致（表4）。说明该方法准确、有效，适用于川产厚朴中厚朴酚、和厚朴酚定量测定。

3 结论与讨论

3.1 提取条件考察

试验中分别考察甲醇、乙醇两种提取溶剂，结果甲醇为提取溶剂时，峰数较多，峰形较好；对60%、70%、100%的甲醇进行考察，结果以70%甲醇为提取溶剂时，各主要色谱峰峰面积较大，信息较丰富，故选用70%的甲醇为提取溶剂。对超声、回流两种提取方式进行考察，得到的供试液的HPLC色谱无明显差异，由于超声操作较方便，故选择超声提取。对提取时间进行考察，结果表明40 min后各时间提取率基本一致，故选择超声时间为40 min。

3.2 洗脱条件的考察

试验中对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水等4个系统的流动相考察，最终确定在乙腈-0.1%磷酸水作为流动相条件下，分离度较好，且基线稳定，有利于指纹图谱分析，因此采用乙腈-0.1%磷酸水作为流动相系统。

3.3 检测波长的考察

试验通过使用DAD检测器在波长190 nm～400 nm紫外区进行全波长扫描，测定其最大吸收波长分别为紫丁香苷265 nm、木兰花碱265 nm，厚朴酚294 nm，和厚朴酚294 nm。基于各成分最大吸收波长不同，且厚朴中厚朴酚、和厚朴酚含量远远高于其他成分，为确保厚朴药材指纹图谱的全面性，减少含量差异显著带来的干扰，本试验采取HPLC波长切换技术测定厚朴药材的HPLC指纹图谱及厚朴酚、和厚朴酚的含量测定。

本试验建立的指纹图谱较文献有一定的进步。本试验中首次应用多波长切换技术对42批四川不同产地厚朴样品进行HPLC指纹图谱的测定，在四川厚朴药材中共标定9个共有峰，通过对照品比对，对其中紫丁香苷、木兰花碱、厚朴酚、和厚朴酚4个共有峰进行了指认，完善了厚朴指纹图谱的信息。结合相似度计算和聚类分析对指纹图谱进行综合评价，发现四川各产地厚朴药材之间的相关性与相似度分析结果较为一致，42批厚朴样品HPLC色谱图相似度为0.868～0.990，说明各产地厚朴中成分组成差异较小。

本试验对不同产地厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的总含量分析可知，其范围在14.36 mg/g～65.58 mg/g，各个产地含量差异显著。厚朴酚、和厚朴酚作为厚朴中主要活性成分之一，据相关研究发现不同质量浓度的厚朴酚、和厚朴酚对鼻咽癌细胞系HONE1进行处理，浓度越大，对HONE1抑制效果更明显；在双向调节胃肠运动，肝脏保护等多方面的作用，发现厚朴酚（0.3 μmol/L～30 μmol/L） 可剂量依赖性增加回肠纵行肌收缩的频率和振幅。此外和厚朴酚对致龋菌产酸均有一定的抑制作用，且随着药物浓度增加，抑制作用增强[12-14]。证明了厚朴酚、和厚朴酚的含量对调整胃肠运动、抗菌、抗炎、抗肿瘤方面呈一定的量-效关系。因此提示我们在评价厚朴药材质量时，不仅要符合药典规定，还需关注厚朴酚、和厚朴酚含量对其药效作用的影响，从而建立厚朴中厚朴酚、和厚朴酚总含量的有效范围，为全面评价四川厚朴药材的质量提供合理的参考。