利用青霉素结合蛋白检测青霉素类抗生素残留

鞠守勇，陈其国，李莉

（武汉职业技术学院生物工程学院，湖北武汉430074）

畜牧业为广大人民提供生活所必需的奶、肉、蛋等畜产品，虽然国家加大了对该类产品的监管力度，但在一些地区，仍然存在着在饲料中添加抗生素，非法使用抗生素兽药等问题，导致某些地区某些产品存在着严重的抗生素残留问题，严重危害消费者的身体健康。2008年10月9日，国务院通过了《乳品质量安全监督管理条例》（国务院令第536号），将抗生素残留检测项目列为强制性检测项目。2008年12月31日，国家也制定了牛奶和奶粉中抗生素残留的检测标准GB/T 22975-2008《牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和双氯西林残留量的测定液相色谱-串联质谱法》。国家虽然加强了对畜牧业养殖中抗生素使用的监管，也制定了一系列的管理条例以及标准，但是目前的现状并不乐观[1]。

青霉素类（β-内酰胺类）抗生素因其价格低廉、抗菌谱广泛一度成为我国畜牧业养殖中使用最普及的一类抗生素，不可避免地在各种畜牧业食品中造成残留。长期摄入含有青霉素类抗生素残留的食品则破坏人体胃肠道等菌群的平衡，造成腹泻等症状，严重时甚至引起呼吸困难，休克，危及生命[1]。食品中青霉素类抗生素残留检测方法主要有：理化检测法、微生物法和免疫检测法[2-4]。理化检测法主要包括：气相色谱（gas chromatography，GC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）、荧光分析等[2-5]，例如，目前牛奶和奶粉中青霉素类抗生素残留国家标准检测方法为液相色谱-串联质谱法GB/T 22975-2008《牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和双氯西林残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，理化检测法有诸多优点，但该类方法往往需要昂贵的仪器设备，样品必须经过繁琐的前处理。免疫检测法一般是利用抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应而发展起来的一种综合性技术，这种方法具有操作简单、成本低廉、灵敏高、特异性强、检测快速等优点[3-4，6]。目前，这种方法越来越多被用于食品中抗生素残留的检测，国外已经有免疫检测抗生素残留试剂盒上市。例如英国Randox公司、意大利Tecna及美国 Charm Science 公司等[2，6]。

青霉素结合蛋白（penicillin binding protein，PBP），因能和青霉素类抗生素共价结合而得名，该蛋白质是一类在细菌肽聚糖生物合成中起重要作用的酶类，它一般具有糖基转移酶、肽基转移酶和羧肽酶（D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶）活性，能够催化肽聚糖聚合和交联[7]，根据PBP的相对分子质量大小及催化活性不同，可以将PBP分为PBP1、PBP2、PBP3等三大类[8]。肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）耐药菌株和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的PBP研究比较深入，肺炎链球菌共有 PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2x、PBP2b和PBP3这6种PBP，金黄色葡萄球菌存在5种 PBP，分别是 PBP1、PBP2、PBP3、PBP4 及 PBP2b[9]。PBP的研究重点往往在于PBP与青霉素类抗生素共价结合的能力[7-9]，该蛋白质用于食品青霉素类抗生素残留检测的应用比较少。

本文从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中克隆并表达了一种新型青霉素结合蛋白Bt-PBP3，并证实其与多种青霉素类抗生素有特异性相互作用，利用直接竞争性酶联免疫方法证实该蛋白可以检测牛奶中多种青霉素类抗生素残留，为下一步研发具有自主知识产权的牛奶中青霉素类抗生素快速检测试剂盒提供了宝贵的基因及蛋白质资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株和质粒

苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）BMB171、大肠杆菌E.coli DH5α、大肠杆菌表达宿主E.coli BL21（DE3）、表达质粒 pET28a（+）：Invitrogen公司。

1.1.2 主要试剂和培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH值7.0～7.4，121℃灭菌30 min。限制性内切酶、pfu Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等分子生物学试剂：北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司；Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒（CW0894S）：北京康为世纪生物科技有限公司；氯化钠、青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林等常规生化试剂均：国药集团。

1.1.3 仪器

PCR 仪（Peltier Thermal Cycler）：美国 MJ Research公司；离心机（Eppendorf 5415D）：德国 Eppendorf公司；凝胶成像系统（3Y GAS-2000）：美国柯达公司；电泳仪（DYY-11）：北京六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 Bt总DNA的提取

按照文献[10]方法提取总DNA。挑取Bt BMB171菌株，液体LB培养基活化后1%转接到LB液体培养基，30℃，300 r/min左右培养至对数生长期。

1.2.2 Bt-pbp3基因的克隆

按照文献[10]方法以Bt BMB171总DNA为模板，PCR扩增Bt-pbp3基因。PCR反应体系为：总DNA模板 1 μL，引物（10 μmol/L）各 2 μL，dNTP 2 μL，Pfu Taq 酶 1 μL，总反应体系 50 μL。反应程序 94 ℃ 5 min，95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环。

1.2.3 Bt-pbp3基因的表达载体的构建

按照文献[10]方法，琼脂糖电泳后分别切胶回收PCR 产物与 pET28a（+）载体，37℃NdeI和 XhoI双酶切，切胶回收外源和载体，T4连接酶16℃过夜连接，CaCl2法转化导入E.coli BL21（DE3），涂布含有卡拉霉素LB平板中，24小时后，进行质粒快检，随机选取3个阳性结果，转接液体LB培养基培养，收集菌体抽取质粒，酶切验证，再测序验证无突变后为表达载体pET28a（+）-pbp3构建成功。表达菌株E.coli BL21（DE3）（pET28a（+）-pbp3）命名为 E.coli Bt-PBP3。

1.2.4 Bt-PBP3蛋白的诱导表达及纯化

按照文献[10]方法，挑取E.coli Bt-PBP3单菌落，37℃过夜活化，1/100接种至卡拉霉素LB液体培养基，培养至OD600约为0.6，加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导，16℃，250 r/min过夜诱导培养后菌液冰上预冷5 min；4℃，12 000 r/min离心收集菌体，预冷无菌水洗涤菌体一遍。按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒说明书操作方法（www.cwbiotech.com），提取可溶性蛋白。随后10 kDa截流管去除咪唑，PBS复溶，得到纯化蛋白质Bt-PBP3。

1.2.5 Bt-PBP3蛋白测定牛奶中青霉素类抗生素残留

用PBS配制不同浓度梯度青霉素类抗生素标准溶液，用辣根过氧化酶标记的不同的青霉素类抗生素（horseradish peroxidase-ampicillin，HRP-Amp），制成终浓度为2 g/L PBS缓冲溶液，纯化的Bt-PBP3蛋白作为包被蛋白，参照文献[2]直接竞争微孔板检测方法，具体步骤如下：用PBS将纯化的Bt-PBP3稀释成适当浓度加至酶标板，每孔100 μL，4℃过夜。倾去孔内液体，每孔加入 300 μL PBST（PBS+0.05%Tween-20）洗涤液洗涤，在吸水纸上拍干。每孔中加入150 μL 1%BSA封闭液，37℃孵育3小时后直接甩干。各孔依次加入50 μL反应缓冲液或者标准品、50 μL稀释成一系列浓度的酶标记物，37℃孵育30 min。倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3遍，吸水纸上拍干。加入100 μL新配置的四甲基联苯胺溶液（tetramethyl benzidine，TMB），室温避光孵育10 min，立即向每孔中加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止液，蓝色变黄色，迅速放入酶标仪中，450 nm波长测定吸光度值A450。

1.3 数据处理

每次试验重复3次以上，所得数据用进行Origin软件方差分析并作图。

2 结果与分析

2.1 Bt-pbp3基因的克隆

根据已经报道的与青霉素类抗生素有高亲和力的蛋白质 PBP3序列（GI：15458372），通过 BLASP 扫描苏云金芽胞杆菌BMB171基因组[11]，发现一个其同源覆盖度为92.4%，相似度为36.6%的蛋白质，全长为415个氨基酸，分子量为45.5 kDa，命名为Bt-PBP3，其基因命名为Bt-pbp3。根据该基因的序列，在该基因上游添加NdeI酶切位点设计引物为CCGCATATGCCATATAGCAATGCATC，下游添加XhoI酶切位点设计的引物为：CGCTCGAGTTAAAACCAACCTTTTACTG，PCR扩增该基因。琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物大小与预期一致约1.3 kb（图1），测序表明PCR产物核苷酸序列与预期一致。

图1 PCR扩增得到Bt-pbp3基因的凝胶电泳图Fig.1 The gel electrophoresis of gene Bt-pbp3 amplification products

2.2 表达载体pET28a（+）-pbp3的构建

分别用NdeI和XhoI双酶切扩增得到的PCR产物Bt-pbp3与载体pET28a（+），切胶回收载体和外源，T4连接酶连接成pET28a（+）-pbp3重组载体，转化表达宿主菌E.coli BL21（DE3），提取质粒用EcoRV，XhoI酶切验证与预期符合大小为3.9、2.5 kb（图2），测序结果表明pbp3基因未发生突变，表明表达宿主菌E.coli BL21（DE3）（pET28a（+）-pbp3）构建成功，将其命名为E.colI Bt-PBP3。

图2 pET28a（+）-pbp3用EcoRV，XhoI酶切片段Fig.2 The cleaved fragments of pET28a（+）-pbp3 using EcoRV，XhoI restriction enzyme

2.3 Bt-PBP3蛋白的诱导表达及纯化

依照1.2.4方法诱导并纯化蛋白质Bt-PBP3，用10 kDa截流管去除咪唑，用PBS缓冲溶解Bt-PBP3蛋白质，通过SDS-PAGE显示纯化的蛋白为单一条带且无明显杂蛋白，蛋白质分子量大小分子量约为45 kDa符合预期（图3），以小牛血清白蛋白（BSA）为指示蛋白，标准绘制标准曲线，测定蛋白质浓度。

图3 SDS-PAGE检测大肠杆菌中分离提取的Bt-PBP3蛋白质Fig.3 The SDS-PAGE of Bt-PBP3 protein extracted from E.coli

2.4 Bt-PBP3蛋白质测定牛奶中青霉素G残留

配置青霉素G标准溶液，浓度0.25 ng/mL到1 024 ng/mL两倍递增。依照方法12.5方法，测定不同青霉素标准溶液中与Bt-PBP3在450 nm波长测定吸光度值A450。在青霉素G浓度在1 ng/mL到64 ng/mL区间中，两者有很好的共线性，以A450为纵坐标，青霉素G浓度为横坐标，标准曲线为B/B0=-0.202 4 ln（CAmp）+0.9606，R2=0.9969。计算得出其IC50=4.842ng/mL（图4）。

图4 不同浓度青霉素G下测定的标准曲线Fig.4 Calibration curve of penicillin G in different concentrations

根据检出限的定义LOD=3δcef/D（其中δcef为空白的相对标准偏差，D为线性方程的斜率）计算，本方法测定青霉素残留的检出限为1.49 ng/mL。依据此方法测定氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林的检测标准曲线，表1表明这6种青霉素类抗生素药的残留检测限除氨苄西林高于国家标准检测限之外，灵敏度稍差，其他均低于国家标准检测限，能满足青霉素类抗生素残留的检测要求。

表1 检测灵敏度Table 1 The detection sensitivity

2.5 Bt-PBP3蛋白质测定牛奶中青霉素类抗生素的检测灵敏度

在不含有青霉素G的脱脂牛奶中添加一定量的青霉素G，添加终浓度为2.5、5、10 ng/mL，平行检测样品中青霉素G的含量，6个平行重复，表2结果表明，当牛奶中添加浓度分别是2.5、5、10 ng/mL时，其添加回收率分别平均达到 （88.9±13.1）%、（90.8±8.4）%、（94.0±7.2）%，表明该方法能用于牛奶中青霉素G残留的测定。

表2 添加回收率的测定Table 2 The test of adding recovery rate

3 结论

本文从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiesis，Bt）中克隆并表达了一种与青霉素类抗生素具有广谱高亲和力的新型青霉素结合蛋白Bt-PBP3，并且建立了直接竞争酶联法快速准确的测定牛奶中青霉素类抗生素的残留的方法，该方法检测青霉素类抗生素的限度低于国家标准且具有灵敏度高，操作简单，能满足快速检验和测试的需求。该蛋白质的克隆表达为进一步研发具有自主知识产权的青霉素残留免疫检测产品奠定了基础。