基于PCR-DGGE研究琚湾酸浆水中细菌多样性及乳酸菌的分离鉴定

蔡宏宇，葛东颖，马磊，张振东，叶万海，余海忠，郭壮，赵慧君，*

（1.湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053；2.枣阳食品药品监督管理局，湖北枣阳441200）

酸浆面为湖北省枣阳市的独特面食，发源于清朝，距今已有100多年的历史，2013年被列入湖北省第四批非物质文化遗产名录。枣阳酸浆面的最佳食用时间为每年的4月至10月，在这段时间温度适宜乳酸菌生长，采用白菜和芹菜制作的酸浆经过一天的发酵，晚上食用酸度刚好。乳酸菌是（Lactic acid bacteria，LAB）一种习惯上的称呼，是一种发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称[1]。乳酸菌分布广泛，物种多样性非常丰富，红酒[2]、白酒[3]、发酵蔬菜[4-6]、乳品[7-8]等发酵食品中均蕴藏着丰富的乳酸菌资源。

聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术广泛地运用到研究微生物生态，在发酵食品中也有非常广泛地应用。意大利葡萄酒中植物乳杆菌和酒球菌的多样性[9]、印度尼西亚单贝浸泡过程中微生物的群落结构和多态性[10]、丹魄酒苹果酸发酵时期细菌的生物多样性和动态变化[11]、不同来源的郫县豆瓣酱中真菌多样性[12]、浆水中细菌多样性[4]等均采用了PCR-DGE的方法进行了分析。

为了发掘枣阳酸浆水中蕴含的乳酸菌资源，研究枣阳酸浆水乳酸菌的多样性，从枣阳市琚湾镇不同酸浆面馆采集酸浆水，采用了PCR-DGGE方法对酸浆水中细菌的群落结构和多样性进行了研究，同时利用纯培养的方法分离纯化酸浆水中的乳酸菌。通过本研究不仅可以了解枣阳酸浆水中细菌的群落结构和多样性，也为后续开发菌种制剂和枣阳酸浆面的生产工业化、标准化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

聚丙烯酰胺、N，N-亚甲基二丙烯酰胺：国药集团化学试剂有限公司；D5625-01 DNA提取试剂盒（OMEGA）、DNA marker（FERMENTAS）、PCR清洁试剂盒（AXYGEN）：北京科博汇智生物科技发展有限公司；2×PCR mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rTaq、dNTP，pMD18-T vector：大连宝生物技术有限公司（TaKaRa）；PCR引物合成和测序由武汉天一辉远生物科技有限公司完成。

1.2 仪器与设备

CT15RE冷冻离心机：日本HITACHI公司；VeritiTM96-well thermal cyclerPCR 仪、NanoDrop 2000/2000c：美国Thermo Fisher公司；DCodeTMSystem：美国Bio Red公司；水平电泳仪：北京六一仪器厂；FluorChem FC3：美国protein simple公司；Bio-5000 plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；Whitley DG250厌氧工作站：英国DWS公司。

1.3 试验样品

本试验所用材料采集于湖北省枣阳市琚湾镇酸浆面馆。分别在10个独立制作酸浆的酸浆面馆采集未煮沸的酸浆水，采集后低温保存，带回实验室进行后续试验。

1.4 试验方法

1.4.1 宏基因组DNA的提取与检测

采用omega D5625-01试剂盒提取10个酸浆水样品中的宏基因组DNA，提取后用0.8%琼脂糖凝胶进行检测并用NanoDrop测定DNA的浓度。

1.4.2 PCR扩增细菌和乳杆菌16S rDNA基因片段

将提取的宏基因组DNA浓度调整一致后作为模板进行PCR扩增。细菌16S rDNA基因片段PCR扩增所用的引物为：正向引物为ALL-GC-V3F（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’），反向引物为 ALL-V3R（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’）；乳杆菌16S rDNA基因片段PCR扩增所用的引物为：正向引物为LacF-GC（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’），反向引物为 LacR（5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3’）[13]。PCR 扩增体系为2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTP（2.5 mol/L），0.5 μL 正向引物 （10 mmol/L），0.5 μL 负向引物（10 mmol/L），0.5 μL rTaq（5 U/μL），1 μL DNA 模板，18μL无菌水。PCR反应条件：95℃4 min预变性，95℃30 s，55 ℃（或 58 ℃）30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增结束后，取扩增产物5 μL用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.3 DGGE及数据分析

细菌和乳杆菌DGGE均采用变性剂线性梯度为35%～60%，浓度为8%的聚丙烯酰胺浓度（40%丙烯酰胺/N，N-亚甲基二丙烯酰胺）凝胶进行电泳，PCR扩增产物上样量为10μL。电泳时，温度为60℃，先120V，78 min；后80 V，13 h。电泳结束对聚丙烯酰胺凝胶进行银染[14]，用扫描仪采集凝胶电泳图片，并用Quantity One软件分析图片。

1.4.4 DGGE胶上优势条带的测序、比对及进化树构建

将细菌DGGE胶上的优势条带进行用不含GC夹子的引物进行扩增，扩增程序同上。与T-载体连接后转化到大肠杆菌TOP10中，鉴定阳性克隆并送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。将测序结果除去两端载体的序列，然后利用NCBI Blast从GenBank数据库中提取相似度比较高的相似的序列，用MEGA 4.0软件制作系统发育树，采Neighbor-joining（邻位相连法）制作系统进化树[15]，利用Bootstrap（自展法）检测制作的系统树[16]，自展数据集为1 000次。

1.4.5 枣阳酸浆水中乳酸菌的分离与纯化

用灭菌枪头吸取0.5 mL酸浆水样品于4.5 mL的生理盐水（质量分数0.85%）中，充分混匀，以10倍稀释法对其进行梯度稀释后，吸取100 μL稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液涂布与含有1.5%的CaCO3固体MRS培养基上并置于厌氧工作站37℃培养48 h。挑取有透明圈的菌落进行革兰氏染色，染色结果为阳性的在MRS固体培养基上划线纯化两次，镜检为单一菌落的保存在-80℃冰箱待用。

1.4.6 枣阳酸浆水中乳酸菌的鉴定

溴化十六烷三甲基铵（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取疑似乳酸菌DNA并用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，采用通用引物27f（5’-A GA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和 1495r（5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’）对乳酸菌16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR扩增体系为2.5 μL 10×PCR Buffer（含 Mg2+），2 μL dNTP （2.5 mol/L），0.5 μL 27f（10 mmol/L），0.5μL 1495r（10 mmol/L），0.5 μL rTaq（5 U/μL），1 μL DNA 模板，18 μL 无菌水。PCR 反应条件：95℃ 4 min预变性，95℃1 min，55℃ 1 min，72℃1 min 30 s，30个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增结束后，取扩增产物5 μL用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。对于符合大小的扩增产物，对PCR产物进行清洁，并连接pMD-18T载体转化到大肠杆菌TOP10中，鉴定阳性克隆并送往武汉天一辉远生物科技有限公司测序。

1.4.7 枣阳酸浆水中乳酸菌的进化分析

枣阳酸浆水中乳酸菌的进化分析方法同1.4.4进化树构建方法。

2 结果与分析

2.1 酸浆水中细菌和乳杆菌16S rRNA V3区域扩增产物DGGE图谱分析

枣阳酸浆水中的DNA提取成功后，进行细菌和乳杆菌16S rRNA V3区域扩增，扩增片段大小200 bp左右，且无非特异性扩增，可以用于DGGE分析。10个枣阳酸浆水样品的细菌和乳杆菌DGGE结果如图1所示。

图1 枣阳酸浆水细菌DGGE图谱和乳杆菌DGGE图谱Fig.1 DGGE analysis of bacteria and lactobacillus in Zaoyang suanjiangshui

DGGE图谱中条带的数量反映样品中微生物的多样性，条带的亮度在一定程度上能反映菌种数量的多少。从图1中可以看出，细菌（A）与乳杆菌（B）DGGE图谱的差异就在于细菌DGGE图谱的最下面有标号6、7两个条带，其余部分基本相同，且两个DGGE胶变性剂梯度相同，因此推断细菌DGGE除6、7条带外其余条带与乳杆菌DGGE基本相同。

2.2 枣阳酸浆水中细菌DGGE图谱聚类分析

枣阳酸浆水中的细菌聚类分析见图2。

图2 枣阳酸浆水中的细菌聚类分析Fig.2 The cluster analysis of bacteria in Zaoyang suanjiangshui

由图2可知，初步将10个酸浆水样品分为了三类，第一类（5#），第二类（1#，2#，8#），第三类（3#，4#，6#，7#，9#，10#），这与图1的直观反映是一致的。反映在DGGE图谱中就是在这些酸浆水中既存在一些共有的细菌，又存在一些特有的细菌种群。由于枣阳酸浆的制作是以家庭为单位进行的，所以酸浆水中的细菌种类不但与制作酸浆的材料有关，也与酸浆水续用次数和家庭环境相关，造成了DGGE图谱上细菌种群丰度存在着一定的差异。

2.3 枣阳酸浆水中细菌DGGE条带测序及系统发育分析

对枣阳酸浆水样品DGGE图谱上的代表性亮带进行切胶、扩增、克隆和测序，与NCBI上的模式菌株进行比对（表1）并构建进化树（图3）。

表1 枣阳酸浆水中细菌DGGE条带比对结果Table 1 Blast results of DGGE in Zaoyang suanjiangshui

图3 枣阳酸浆水中细菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria in Zaoyang suanjiangshui

由图3可知，测序结果分为了3个类别，类别I聚集了大多数序列，主要为Lactobacillus amylolyticus和Lactobacillus delbrueckii，包含条带 1、2、4、5、7、8 和12。类别II为Lactobacillus fermentum和Lactobacillus panis，包含条带 3、6、9、10 和 11。类别 III为 Lactobacillus acidipiscis，只有条带13。从系统发育来看，乳杆菌占据了大部分比例，且具有一定的多样性。

2.4 枣阳酸浆水中分离乳酸菌的比对结果

利用含有1.5%CaCO3的MRS培养基分离枣阳酸浆水中的乳酸菌，挑选有透明圈、革兰氏染色为阳性的菌株进行分子生物学鉴定，最终从枣阳酸浆水中分离出15株乳酸菌，均为乳杆菌。测序结果在NCBI上进行比对（结果见表2），其中10株为Lactobacillus fermentum，3株为 Lactobacillus plantarum，一株为 Lactobacillus agilis，一株为 Lactobacillus delbrueckii。这与PCR-DGGE的结果是相同的，Lactobacillus fermentum在酸浆水中为优势菌属。

表2 枣阳酸浆水中16S rDNA基因序列的分析结果Table 2 Results from 16S rDNA sequences analysis of Zaoyang suanjiangshui

对枣阳浆水中的乳酸菌进行系统进化分析，结果见图4。

图4 基于16SrDNA基因序列构建枣阳酸浆水中乳酸菌系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA region gene sequences of lactobacillus in Zaoyang suanjiangshui

从图中看以看出，编号为 1、3、4、6、7、8、10、13、14和15的归为一类，均为Lactobacillus fermentum；编号为5和9为归为Lactobacillus plantarum；编号为2的归为Lactobacillus agilis；编号为11的归为Lactobacillus delbrueckii。

3 结论

以细菌16S rDNA基因序列为靶点基于PCRDGGE技术对枣阳酸浆水中细菌多样性进行了分析，发现在酸浆水中绝大多数细菌为乳酸菌，但是不同地点采集的酸浆水细菌的多样性并不一致。对DGGE中的典型条带进行测序分析，13个典型条带的测序结果归为5个菌属，分别为Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillusdelbrueckii、Lactobacillusfermentum、Lactobacillus panis和 Lactobacillus acidipiscis，其中 Lactobacillus fermentum在所有样品中均存在且为最具优势的乳酸菌。利用纯培养的方法从枣阳酸浆水中分离出15株乳酸菌，测序后发现均为乳杆菌，其中10株为Lactobacillus fermentum，这与PCR-DGGE的结果是一致的。因此推断，枣阳酸浆水中乳酸菌为主要的细菌，其中乳酸菌的优势菌株为Lactobacillus fermentum。