玳玳花黄酮提取物抗肝癌细胞氧化损伤作用探究

庞海月，吴黉坦，郑永标，陈煜沛，黄立森，叶子坚，王贵弘

（1.厦门医学院医学技术系，福建厦门361023；2.厦门医学院天然化妆品福建省高校应用技术工程中心，福建厦门361023；3.福建师范大学生命科学学院工业微生物教育部工程研究中心，福建福州350117）

玳玳花（Citrus aurantium）为芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus reticulata Banco）的常绿灌木，分布于中国南部各地区。玳玳花全草含有强心甙和非强心甙类成分，在多国药典中均有记录。中医称之具有强心、镇静、疏肝理气、消食、化痰等功效，用于治疗慢性心功能不全、充血性心力衰竭和癫痫等急性病。玳玳花作为茶饮，微苦，香气浓郁，具有减肥瘦身的效果。玳玳花花蕾中的挥发油主要有柠檬烯、芳樟醇、香茅醇、牦牛儿醇等。文献检索发现，玳玳花的研究多集中于其香气和精油成分，对其萃取物的整体研究较少。

随着科技的发展，人类在人体衰老课题研究中取得越来越多成果，尤其对氧化损伤与衰老的关系进行了较多阐述，更初步证实了自由基引起的氧化损伤是人体衰老的主要元凶。本研究采用5种体外抗氧化活性评价方法对玳玳花黄酮的抗氧化活性进行初步评价，并利用H2O2和对乙酰氨基酚（4-Acetamidophenol，APAP）诱导的肝癌细胞损伤模型，对其细胞水平的抗氧化能力进行测定，为其之后能够作为天然食品和化妆品类抗氧化剂及抗衰老的应用做基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玳玳花由福建省农科院生态所林忠宁副研究员提供；人肝肿瘤细胞株HepG2来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

大孔吸附树脂D101、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（Butylated hydroxytoluene，BHT）、吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate，PMS）、硝基蓝四氮唑（Nitro blue tetrazolium，NBT）、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、对乙酰氨基酚（4-Acetamidophenol，APAP）、没食子酸（Gallic acid，GAE）、福林酚（Folinciocalteau reagent）：国药集团化学试剂有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（dihydronicotinamide-adenine dinucleotide，NADH）：美国Sigma公司；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）、10 mmol/L Trolox标准溶液：碧云天生物技术研究所。所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FreeZoneR冷冻干燥机：美国LABCONCO公司；EYELA旋转蒸发仪N-1100：日本东京理化器械株式会社；多功能酶标仪SpectraMaxRi3x：美国Molecular Devices公司；梅特勒ME204E电子天平：梅特勒-托利多国际股份有限公司；Thermo BB15 CO2细胞培养箱：精艺兴业科技有限公司；徕卡DMi8倒置显微镜：精艺兴业科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玳玳花黄酮的获取

玳玳花粉碎后，准确称取100 g，加纯水[液料比5∶1（mL/g）]，超声波功率为 600 W，超声萃取 4 h，过滤，45℃水浴减压旋转浓缩，浓缩至褐色浸膏。经少量纯水重新溶解后，滤纸过滤，冷冻干燥处理得到粗提物样品12.16 g，4℃冰箱备用。

称取大孔树脂D101 50 g，加入无水乙醇浸泡24 h激活。之后将激活的大孔树脂装入长25cm，直径1.5cm的层析柱中，用无水乙醇冲洗至洗脱液滴入纯水中无浑浊现象，再用纯水洗脱至洗脱液澄清，管柱上方留1 cm～2 cm高的液面。称取1.3.1中得到的粗提物样品1 g用少量纯水溶解后，湿法上样。先用纯水200 mL洗脱后，再用25%的乙醇-水溶液洗脱，此洗脱液经减压浓缩，冷冻干燥后即为玳玳花黄酮（Citrus aurantium flavones，CF），黄酮含量为 2.68 mg/g。

1.3.2 总抗氧化能力测定

参照ABTS试剂盒说明配制ABTS所需工作溶液。用样品配制溶液对标准品进行稀释。把10 mmol/L Trolox 标准溶液依次稀释成 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。在96孔板的每孔中加入200 μL ABTS工作液，空白对照孔中加入10 μL蒸馏水；标准曲线检测孔内加入10 μL各浓度的Trolox标准溶液；样品检测孔中加入10 μL待测样品。将加好样品的孔板混和均匀，室温孵育2 min～6 min后测定734 nm处的吸光值。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力，用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity（TEAC）表示，即所测样品的总抗氧化能力用同等抗氧化效果的Trolox的浓度来代表。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的测定

参照文献[3]方法，准确称取一定量的DPPH，用无水乙醇配置成0.1 mmol/L的溶液，避光冷藏备用。将待测样品稀释成不同浓度（0.012 5、0.025、0.5、1 mg/mL），阳性对照和空白对照分别采用BHT和无水乙醇。取200 μL样品液和对照溶液，均加入等体积的0.1 mmol/L DPPH溶液，涡旋混匀，室温下避光反应30 min，在517 nm测定吸光值，计算DPPH自由基清除率。

式中：OD0为不加样品的空白组；OD1为扣除干扰色后的样品组。

1.3.4 清除超氧阴离子（SOD-like）能力测定

用无菌水配制 60 μmol/L PMS、468 μmol/L NADH及150 μmol/L NBT工作液。取100 μL无菌水、浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL 的样品溶液和BHT溶液依次与100 μL PMS、NADH及NBT溶液混合均匀，加入96孔板中，每个浓度设置3孔重复，室温静置5 min后，以酶标仪测各孔于560 nm处的吸光值。

式中：A0为未添加样品的对照组；A1为添加样品的实验组。

1.3.5 MTT检测样品对HepG2细胞株的作用

选择对数生长期贴壁细胞，以每孔100 μL（5×103个细胞）接种于96孔板，培养24 h后，加入用DMSO溶解的样品（终浓度为 0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL）每个浓度设3组重复，补充培养液使每孔的总体积为200 μL（每孔的DMSO含量低于2.5%），继续培养24 h。空白对照组（Control）以含DMSO的培养液代替样品，空白调零组为无细胞培养液。培养结束后，每孔加入10 μL 0.5 mg/mL MTT培养5 h，吸除干净每孔中的培养液，加入200 μL DMSO充分溶解，用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光值，计算细胞相对存活率。

式中：A0为未添加样品的对照组；A1为添加样品的实验组。

1.3.6 HepG2细胞株氧化损伤测定

选择对数生长期贴壁细胞，以每孔100 μL（5×103个细胞）接种于96孔板，培养24 h后，加入用DMSO溶解的样品（终浓度为 0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL）每个浓度设3组重复，补充培养液使每孔的总体积为200 μL（每孔的DMSO含量低于2.5%），继续培养24 h后，加入终浓度为400 μmol/L H2O2（或12 mmol/L APAP）继续培养 6 h。空白对照组（Control）以含DMSO的培养液代替样品，空白调零组为无细胞培养液。培养结束后，在倒置显微镜下观察各组检测孔中细胞形态的变化并拍照。之后每孔加入10 μL 0.5 mg/mL MTT培养5 h，吸除干净每孔中的培养液，加入200 μL DMSO充分溶解，用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光值，计算细胞相对存活率。

式中：A0为未添加样品的对照组；A1为添加样品的试验组。

2 结果与分析

2.1 CF抗氧化活性

以Trolox为标准物质，测得标准方程：R2=0.999 1通过标准方程计算CF总抗氧化能力，结果表明，CF的总抗氧化活性为（5.28±0.02）mmol/g；通过对DPPH自由基清除能力测定，结果表明其半数抑制率浓度为（0.52±0.02）mg/mL；通过对超氧阴离子（SOD-like）清除能力测定，结果表明其半数抑制率浓度为（0.074±0.002）mg/mL。

2.2 CF对HepG2人肝癌细胞株的作用

CF对HepG2细胞株的作用见图1。

通过MTT试验检测CF对人肝癌细胞株HepG2的作用，结果表明CF对HepG2无明显抑制或增强的效果。

2.3 CF抗H2O2诱导的人肝癌细胞株HepG2氧化损伤测定

CF对H2O2诱导HepG2细胞株氧化损伤的作用见图2。

图1 CF对HepG2细胞株的作用Fig.1 The effect of Citrus aurantium flavones on HepG2 cell lines

图2 CF对H2O2诱导HepG2细胞株氧化损伤的作用Fig.2 The effect of Citrus aurantium flavones on hydrogen peroxide-induced oxidative stress of HepG2 cell lines

通过测定CF对H2O2诱导的HepG2的氧化损伤作用，结果表明，在设置的浓度范围内，CF在该模型中表现的作用不同，其中玳玳花黄酮浓度在0.04 mg/mL时，较显著的降低细胞氧化损伤水平。从图2a中H2O2处理组可以看出，H2O2诱导的HepG2细胞在形态出现明显鼓泡、变圆，而经CF预处理的HepG2细胞较H2O2处理组在细胞形态上均有明显改善，图2b中的柱状图更直观的表明不同浓度CF在细胞水平上对H2O2诱导的HepG2的氧化损伤具有一定的修复作用。

2.4 CF抗APAP诱导的HepG2人肝癌细胞株氧化损伤测定

CF对APAP诱导HepG2细胞株氧化损伤的作用见图3。

图3 CF对APAP诱导HepG2细胞株氧化损伤的作用Fig.3 The effect of Citrus aurantium flavones on 4-acetamidophenol-induced oxidative stress of HepG2 cell lines

通过测定CF对APAP诱导的HepG2的氧化损伤作用，结果表明，CF浓度在0.04 mg/mL时，能够降低细胞氧化损伤水平，但当浓度大于0.1 mg/mL或低于0.04 mg/mL时，表现出和12 mmol/L APAP相近的细胞毒性。从图3a可以看出，APAP诱导的HepG2细胞在形态出现明显皱缩、变圆甚至破裂等，而经CF预处理的HepG2细胞较12 mmol/L APAP预处理组在细胞形态上有一定改善，图3b中的柱状图更清晰的看出CF在设定的浓度范围内，在APAP诱导的HepG2的氧化损伤模型中的作用效果。

3 结论

采用总抗氧化能力、DPPH清除能力和SOD清除能力3种生化指标与H2O2和APAP诱导的HepG2细胞模型，共同评估玳玳花黄酮的抗氧化损伤能力。发现CF在生化水平测试中表现出较好的抗氧化能力，而两种细胞模型测定的结果又表现出一定的差异性。在APAP模型中，CF浓度高于0.1 mg/mL时，出现与APAP近似甚至更强的毒性。CF较好的抗氧化能力可为其在食品天然防腐剂的应用提供事实依据，而CF在较高浓度，与APAP共用时表现强烈细胞毒性这一点为其提供了使用量和配伍时的禁忌。本次的研究结论为玳玳花黄酮类提取物之后开发成天然抗氧化剂奠定了一定的理论基础。