不同产地砂仁总酚测定及抗氧化活性比较△

邹晓红，曹骋，曾元儿，江滨

(广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

砂仁为姜科植物阳春砂AmomumvillosumLour.、绿壳砂AmomumvillosumLour.var.xanthioidesT.L.Wu et Senjen或海南砂AmomumlongiligulareT.L.Wu的干燥成熟果实，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效[1]。对于砂仁化学成分的研究多集中于挥发油部分，对其他非挥发性成分的研究较少[2-3]。砂仁中除含有大量的挥发性成分外，还包括酚类、黄酮类、多糖、无机物等多种非挥发性成分[3-5]。目前，国内外尚无关于砂仁总酚的相关研究报道，仅有陈程等[5]对阳春砂仁的酚性成分进行了相关研究。尤小梅等[6]比较了春砂仁根、叶提取物与茶多酚的抗氧化活性，唐建阳等[7]、刘金鹏[8]探究了砂仁的抗氧化活性，发现各提取物具有较强的清除DPPH自由基活性。随着国家日益重视大健康产业的发展[9]，砂仁作为药食两用的药材，有必要深入探讨其所含的各种化学成分及药效。本论文从砂仁的非挥发性成分着手，通过建立福林酚比色法测定砂仁的总酚含量，并测定其对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和铁离子的还原能力来评价砂仁的抗氧化活性，完善砂仁酚性成分的研究，为砂仁酚性成分的深入研究与开发应用、以及更全面地评价砂仁药材的质量提供实验基础。

1 仪器与试药

仪器：L5S紫外可见分光光度计(INESA)；HH-6数显恒温水浴锅(常州市国立试验设备研究所)；AEG-200型分析天平(SHIMADZU)；BP211D十万分之一电子天平(Sartorius)。Multiskan G0酶标仪(Thermo SCIENTIFIC)，移液枪(Sartotius)。

试药：本实验用砂仁样品的来源见表1。所有砂仁样品由广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波副教授鉴定其品种。

表1 24批砂仁样品信息

香草酸对照品(成都普菲德生物技术有限公司，批号：151116，纯度大于98%)，福林酚试剂(上海荔达生物科技有限公司，批号：PRLB09250)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH试剂)(上海源叶生物科技有限公司，批号：W09A7E12633)；奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)(aladdin，批号：F1624018)；总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)(Beyotime，编号：S0119)；总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)(Beyotime，编号：S0116)，色谱甲醇(Merck公司)，超纯水。其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 砂仁总酚提取及含量测定

2.1.1 对照品溶液的配制 精密称取香草酸对照品适量，加甲醇制成质量浓度为0.1 mg·mL-1的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取砂仁样品，去壳，捣碎，过二号筛。取粉末约2 g，精密称定，置150 mL圆底烧瓶中，加20%甲醇70 mL，称定质量。回流提取60 min，放冷后称定质量，补足减失的质量，滤过，收集滤液，即得。

2.1.3 总酚的测定 精密移取供试品溶液适量，置25 mL量瓶中，加福林酚试剂1.5 mL，静置5 min，加10% Na2CO3溶液7.5 mL，加水定容，混匀，暗处放置1 h，以试剂空白为参比，于735 nm波长处测定吸光度值。

2.2 砂仁总酚抗氧化活性测定

2.2.1 DPPH法 取DPPH试剂和Trolox标准品，分别加甲醇配制成158.07 μmol·L-1的DPPH溶液和1.9 mmol·L-1的Trolox母液。参照文献方法[10-11]，设对照组、样品组、样品对照组和空白组。往96孔板中加入相应的试剂混合，对照组为10 μL甲醇+200 μL DPPH试剂；样品组为10 μL样品+200 μL DPPH试剂；样品对照组和空白组分别加入样品溶液和甲醇试剂以排除自身的干扰。

标准曲线检测孔内加入10 μL系列浓度的Trolox标准溶液和200 μL DPPH试剂。各组均重复3次，轻轻混匀。避光反应20 min，于酶标仪517 nm处测定其吸光度(A)值。按公式(1)计算清除率(R)。

R(%)=[1-(Ax-Ax0)/(A1-A0)]×100

(1)

式中：A1为对照组值，Ax为样品组值，Ax0为样品对照组值，A0为空白组值。

2.2.2 ABTS法 参照总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)的总抗氧化能力的测定方法，往96孔板中加入相应的试剂混合，对照组为10 μL蒸馏水+200 μL ABTS工作液；样品组为10 μL样品+200 μL ABTS工作液；样品对照组和空白组分别加入样品溶液和蒸馏水以排除自身的干扰。标准曲线检测孔内加入10 μL系列浓度的Trolox标准溶液和200 μL ABTS工作液。各组均重复3次，轻轻混匀。室温孵育15 min后于酶标仪734 nm下测定吸光度。按公式(1)计算清除率。

2.2.3 FRAP法 参照总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)的总抗氧化能力的测定方法，往96孔板中加入相应的试剂混合，对照组为5 μL蒸馏水+180 μL FRAP工作液；样品组为5 μL样品+180 μL FRAP工作液；样品对照组和空白组分别加入样品溶液和蒸馏水以排除自身的干扰。标准曲线检测孔内加入5 μL系列浓度的FeSO4·7H2O标准溶液和180 μL FRAP工作液。各组均重复3次，轻轻混匀。室温孵育40 min后于酶标仪593 nm下测定吸光度。

3 结果

3.1 砂仁总酚含量测定方法学考察

3.1.1 线性关系考察 分别精密吸取2.1.1项下香草酸对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL容量瓶中，按2.1.3项下方法进行显色并测定吸光度，以吸光度为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行线性回归分析，得回归方程Y=67.92X+0.102 8，r=0.999 5；线性范围为0.002 0～0.011 9 mg·mL-1。

3.1.2 精密度试验 取2.1.1项下香草酸对照品溶液，照2.1.3项下方法显色，测定吸光度值，连续测定5次，计算吸光度的RSD为0.3%(n=5)，表明仪器的精密度良好。

3.1.3 稳定性试验 取云南金平县黄牛克砂仁(S1)供试品溶液，按2.1.3项下方法显色，分别于制备后0、1、2、3、4 h测定其吸光度，计算吸光度的RSD=0.9%(n=5)，表明供试品溶液在4 h内稳定。

3.1.4 重复性试验 取云南金平县黄牛克砂仁样品(S1)，分别按2.1.2项下方法制备供试品溶液，平行5份，按2.1.3项下方法进行显色，测定吸光度值，计算吸光度的RSD为1.9%(n=5)，表明该方法重复性良好。

3.1.5 加样回收率试验 取云南金平县黄牛克砂仁样品(S1)0.30 g，平行6份，精密称定，置圆底烧瓶中，每份精密加入新配制的香草酸对照品溶液(0.500 7 mg·mL-1)2 mL，按2.1.2项下制备供试品溶液方法操作提取，再按2.1.3项下方法，精密移取供试品溶液6 mL，依次加入显色剂进行显色并测定吸光度值，结果见表2，计算得平均加样回收率为96.6%(RSD=3.3%，n=6)，表明该法回收率较好。

表2 砂仁中香草酸加样回收率试验

注：对照品加入量为1.001 4 mg。

3.1.6 总酚含量测定结果 按照2.1.2项制备供试品溶液，对24批不同产地的砂仁药材按2.1.3项方法进行总酚的含量测定，结果见表3。

表3 24批砂仁样品的总酚含量测定结果，n=5)

3.2 砂仁总酚抗氧化测定结果

3.2.1 DPPH法 按照2.2.1项下方法进行DPPH自由基清除能力测定，并以Trolox标准溶液的浓度为横坐标(X)、清除率为纵坐标(Y)进行线性回归分析，得回归方程Y=118.41X+2.559 5，r=0.999 3；线性范围为0.08～0.70 mmol·L-1。根据回归方程计算出样品对DPPH自由基的清除率，结合样品的稀释倍数，转化为达到一定浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox的浓度，也把该方法称为TEAC(Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity)法[12-13]，即样品混合物与Trolox标准品对DPPH自由基具有相同的清除率所对应的Trolox浓度值，测定结果见表4。

3.2.2 ABTS法 按照2.2.2项下方法进行ABTS自由基清除能力测定，并以Trolox标准溶液的浓度为横坐标(X)、清除率为纵坐标(Y)进行线性回归分析，得回归方程Y=85.35X-0.566，r=0.999 7；线性范围为0.05～0.80 mmol·L-1。根据回归方程计算出样品对ABTS自由基的清除率，结合样品的稀释倍数，用TEAC法表示样品的抗氧化能力，测定结果见表4。

3.2.3 FRAP法 按照2.2.3项下方法进行铁离子还原能力测定，并以FeSO4标准溶液的浓度为横坐标(X)、吸光度为纵坐标(Y)进行线性回归分析，得回归方程Y=0.291 2X+0.066 8，r=0.999 6；线性范围为0.5～3.0 mmol·L-1。根据回归方程计算出样品对铁离子还原能力，结合样品的稀释倍数，用FeSO4标准溶液的浓度来表示样品的抗氧化能力，结果见表4。

3.3 不同产地砂仁总酚含量的统计学分析

不同产地的砂仁总酚含量呈正态分布，运用IBM SPSS Statistics 20软件对其含量进行单因素方差分析，结果表明各不同产地的砂仁总酚含量具有统计学差异(P<0.01)。其中总酚含量最高的为购于爱店口岸的老挝砂仁(S18)，为44.02 mg·g-1；含量最低的为云南金平县黄牛克的砂仁(S1)，为3.41 mg·g-1；两者之间相差约12.9倍。通过质心聚类法对不同产地的砂仁样品总酚的含量进行系统聚类，采用平方欧氏距离(Squared Euclidean Distance)获得聚类分析结果，见图1。由聚类分析树状图可以看出，24批不同产地的砂仁被分成两大类，其中总酚含量较高的4批砂仁(S7、S17、S18、S22)归为一类，其余批次的砂仁归为另一类。总体来看，进口砂仁的总酚含量普遍较高，次之为绿壳砂与云南西双版纳一带的阳春砂，而阳春道地产区和云南红河一带引种的阳春砂总酚含量较低。提示砂仁中总酚含量与产地具有一定的相关性。

表4 砂仁总酚抗氧化活性结果，n=3) mmol·L-1

图1 24批不同产地砂仁总酚含量聚类分析树状图

3.4 砂仁总酚与其抗氧化活性的相关性分析

以24批砂仁的总酚含量与其对应的DPPH、ABTS、FRAP法测定的抗氧化活性分别做相关性分析，得相关系数分别为0.966，0.966，0.927。结果显示，3种不同方法测定的抗氧化活性均与总酚含量呈正相关(P<0.01)。

4 讨论

本实验首次采用福林酚比色法测定砂仁的总酚含量，通过全波长扫描确定最大吸收波长为735 nm；并通过实验探索得显色体系各试剂的用量，当福林酚试剂与10%Na2CO3溶液的体积比为1∶5、福林酚试剂用量为1.5 mL时吸光度具有最大值；测定显色体系20～120 min的吸光度变化，发现显色时间达到40 min后吸光度值稳定，本实验选择60 min作为显色完全的最佳反应时间。在总酚的测定过程中，由于不同产地的砂仁总酚含量差距较大，为了控制吸光度值在0.2～0.8以减小误差，加入的供试品溶液量在0.2～2.0 mL。

含量测定结果显示不同产地总酚含量在3.41～44.02 mg·g-1，具有统计学差异。酚类成分多具有抗氧化、清除自由基、抑菌等作用，相关研究报道日益增多[14-15]，砂仁是否具有此类药效作用值得我们进一步去研究。此次实验发现，不同产地的砂仁均具有一定的抗氧化活性，DPPH法的TEAC值在0.31～8.09 mmol·L-1，ABTS法的TEAC值在0.45～11.56 mmol·L-1，FRAP法的FeSO4标准溶液的浓度在0.66～10.03 mmol·L-1。3种方法测定的抗氧化活性均与总酚含量呈显著正相关，相关系数r>0.9，揭示其化学成分活性可能具有相似性。不同产地的砂仁总酚含量以及其抗氧化活性均高低不一，要确保其临床疗效，需要对其含量及具体成分做进一步的研究和控制。砂仁作为药食两用的药材，其产量低、用量大、价格不断攀高，有必要去丰富其化学成分基础知识，充分挖掘利用其药用价值，为更全面地评价砂仁药材的质量提供实验依据，以便砂仁在食品、医药等领域得到更充分的开发应用。