结核感染T细胞斑点试验在糖尿病并发肺结核诊断中的价值

王雅 吴妹英 杨坤云 阿尔泰 吴树才 耿书军 李志惠 李明武 康万里 唐神结

我国是全球结核病30个高负担国家之一[1]，同时也是糖尿病高发国家[2]。糖尿病患者由于糖、脂肪、蛋白质等代谢障碍使其成为结核病的易感人群，而活动性结核病作为一个感染因素又可加重糖尿病、诱发酮症酸中毒等并发症[3]。由于糖尿病并发肺结核患者免疫力低下、早期临床症状和影像学表现不典型等，使传统的诊断方法存在一定的局限性。因此，早期快速诊断技术在糖尿病并发肺结核中的应用可提高诊断阳性率，是改善糖尿病并发肺结核患者预后、控制结核病传播的重要措施。

结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)是基于γ干扰素(IFN-γ)释放试验原理，在酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunos-potassay, ELISPOT)的基础上，应用细胞免疫反应建立起来的检测单细胞水平分泌抗体或细胞因子的新型体外免疫检测法。T-SPOT.TB在潜伏结核感染和活动性肺结核的诊断上具有较高的敏感度和特异度，但大部分研究都是基于结核病低负担国家得出的结论[4-7]，其在结核病高负担国家中的诊断应用还缺乏充足的证据。目前，T-SPOT.TB已被诸多欧美国家的临床诊疗指南推荐用于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)培养阴性肺结核、涂片阴性肺结核及肺外结核等的临床辅助诊断方法[8]。然而，其对糖尿病并发肺结核患者进行诊断的相关研究鲜见报道。笔者探讨T-SPOT.TB检测技术在并发糖尿病的肺结核患者诊断中的应用价值。

资料和方法

一、对象及诊断标准

1.研究对象：对2012年12月至2015年11月在北京胸科医院、苏州市第五人民医院、湖南省胸科医院、新疆维吾尔自治区胸科医院、河北省胸科医院、昆明市第三人民医院结核科住院的302例糖尿病并发肺结核及单纯糖尿病患者进行回顾性分析。207例为糖尿病并发肺结核患者，其中糖尿病并发培养阳性肺结核141例(简称“Ⅰ组”)，糖尿病并发培养阴性肺结核(包括痰涂片阳性和痰涂片阴性患者)66例(简称“Ⅱ组”)；95例为单纯糖尿病患者(简称“Ⅲ组”)。 所有患者均接受了有效的T-SPOT.TB检测，人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体检测均为阴性。所有患者均无免疫系统疾病、未接受免疫抑制剂治疗，并均排除恶性肿瘤。

本研究302例调查对象中，男性240例(79.5%)，女性62例(20.5%)。Ⅰ组141例(46.7%)，Ⅱ组66例(21.8%)，Ⅲ组95例(31.5%)。三组患者年龄(χ2=24.39，P<0.001)、体质量指数(BMI)(χ2=11.07，P=0.004)、卡介苗接种情况(χ2=11.70，P=0.003)比较差异均有统计学意义，而性别、吸烟和饮酒等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2. 诊断标准：肺结核诊断符合中华人民共和国卫生部制定的《WS 288-2008肺结核诊断标准》[9]。培养阴性肺结核的诊断标准：(1)典型肺结核的临床症状和胸部X摄影表现；(2)抗结核药物治疗有效；(3)临床可排除其他非结核性肺部疾病；(4)痰结核分枝杆菌培养阴性。

2型糖尿病的诊断参照文献[10]，即有明显的糖尿病典型症状(包括多饮、多食、多尿、体质量下降)，并满足以下任意一个条件：(1)任意时间血糖≥11.1 mmol/L；(2)空腹血糖≥7.0 mmol/L；(3)空腹血糖≥7.0 mmol/L且口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)2 h血糖≥11.1 mmol/L。

二、实验方法

全血T-SPOT.TB 检测试剂盒由英国 Oxford Immunote公司生产。采集肝素锂抗凝患者外周血5 ml，室温保存，按操作程序分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，稀释成2.5×106/ml 的工作液，在已预先包被IFN-γ抗体的微孔板中分别加入细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素(PHA)作为阳性对照；早期分泌性靶抗原6(early secretory antigenic target 6，ESAT-6) 作为抗原A，培养分泌蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)作为抗原B，各50 μl加入检测孔，然后再在各孔中加入100 μl已配好的单个核细胞工作液，37 ℃ 5% CO2培养 16～20 h；洗板后加入酶标记鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，2～8 ℃孵育1 h，洗板后加底物显色，根据试剂说明书进行阅读并统计。

表1 不同人口学特征在三组患者中的分布情况

T-SPOT.TB 结果判定：当阴性对照孔斑点数为0～5个且测试孔斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6个，或阴性对照孔斑点数6～10个且测试孔斑点数≥2倍的阴性孔对照数为阳性，阳性对照孔斑点数>20个视为实验有效，阴性对照孔斑点数>10个视为结果无法判读，必须重新检测，如阳性对照正常而检测孔斑点数达不到阳性标准则判为阴性[11]。

三、相关公式

敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%;特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；准确度=(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100%。

四、统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析，计数资料采用率值(%)进行统计学描述，组间比较采用卡方检验或Fisher精确概率检验。定量资料的统计描述根据资料分布特征采用“均数±标准差”或中位数、四分位数表示。多组定量资料的组间比较根据资料分布特征采用单因素方差分析或秩和检验(Kruskal-Wallis)。糖尿病并发肺结核T-SPOT.TB 阳性结果的影响因素分析，单因素分析采用卡方检验，如果单因素分析差异有统计学意义，再进行logistic 回归多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、糖尿病并发肺结核患者的临床特征

Ⅰ组咳嗽、咳痰、盗汗、体质量减轻的比率均高于Ⅱ组患者，差异有统计学意义(P值均<0.05)。Ⅰ组患者抗酸杆菌的检出率高于Ⅱ组，差异有统计学意义(χ2=103.96，P<0.01)。结核病变范围相比较，Ⅰ组较Ⅱ组患者分布范围更广泛，差异有统计学意义(χ2=12.58，P<0.01)。结核空洞及其范围相比较，Ⅰ组较Ⅱ组患者分布范围更广泛，差异有统计学意义(χ2=10.71，P=0.003)，见表2。

二、T-SPOT.TB检测的阳性率

T-SPOT.TB检测的阳性率在Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别为92.9% (131/141)(95%CI：87.3%～96.5%)、86.4% (57/66)(95%CI：75.7%～93.6%)、48.4% (46/95)(95%CI：38.0%～58.9%)。Ⅰ组的T-SPOT.TB检测阳性率明显高于Ⅲ组，差异有统计学意义(χ2=59.91，P<0.01)；Ⅱ组的T-SPOT.TB检测阳性率明显高于Ⅲ组，差异有统计学意义(χ2=24.33，P<0.01)；Ⅰ组与Ⅱ组的T-SPOT.TB检测阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=2.31，P=0.129)。

表2 不同临床特征在两组糖尿病并发肺结核患者中的分布

注 表中括号外数值为“患者例数”，括号内数值为“比率(%)”

三、T-SPOT.TB检测的诊断效能

以临床诊断为金标准,T-SPOT.TB检测诊断糖尿病并发肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断准确度分别为90.8%(188/207) (95%CI：86.0%～94.3%)、51.6%(49/95) (95%CI：41.1%～62.0%)、80.3%(188/234) (95%CI：74.7%～85.2%)、72.1%(49/68) (95%CI：59.9%～82.3%)、78.5%(237/302) (95%CI：73.4%～83.0%)。

四、糖尿病并发肺结核患者T-SPOT.TB检测阳性的相关因素分析

T-SPOT.TB 阳性结果与年龄、性别、BMI、痰菌、影像学表现、并发症等因素均没有相关性(P值均>0.05)(表3)。

讨 论

糖尿病是并发结核病的相关疾病之一，随着全球糖尿病发病例数的升高，糖尿病并发肺结核患者的比例也在不断上升[12]。持续高血糖可导致机体蛋白质及脂肪代谢紊乱，引发营养不良，并且可影响白细胞吞噬能力；而组织内含糖量高，以及引起的血高丙酮酸水平有利于MTB生长繁殖，增加结核易感性[13]。糖尿病导致的微血管病变可累及肺部，使肺部通气-血流比例失衡，氧分压增高，损伤气道黏膜，利于MTB在肺部的定植[14-15]；糖尿病还可进一步影响抗结核药物的疗效和结核病患者的预后[14,16]。

表3 各类相关因素对糖尿病并发肺结核患者T-SPOT.TB 检测阳性的影响

注a：采用Fisher精确概率法

而结核病患者出现的发热等中毒症状可反过来加重糖尿病患者的代谢紊乱，诱发酮症酸中毒。一些抗结核药物也可干扰糖代谢，加重糖尿病的并发症[17]。糖尿病并发肺结核患者与单纯肺结核相比，临床表现多样化，病情进展迅速，病变范围广，干酪病灶多，病死率和复发率高，属难治性肺结核范畴。所以准确、快速地诊断糖尿病并发肺结核具有非常重要的临床意义，是改善糖尿病并发肺结核患者预后、控制结核病传播的重要途径[16]。

目前，结核病的诊断主要依靠临床症状、影像学、痰涂片、痰分枝杆菌培养和结核菌素皮肤试验(TST)等，糖尿病并发肺结核患者临床症状及影像学表现往往不典型，痰涂片阳性率和特异度相对较低，临床上易造成漏诊和误诊[13]。MTB培养阳性是结核病诊断的金标准，但分枝杆菌培养耗时长，培养条件严格，且痰液样本质量的不确定性将严重影响其诊断敏感度[18]。而传统TST与卡介苗存在交叉反应，会出现较高的假阳性，且敏感度受到患者细胞免疫功能的影响，在糖尿病患者人群中的敏感度不高，其诊断的实际应用价值十分有限[19]。

T-SPOT.TB是以ELISPOT试验原理为基础发展而来，基于MTB的RD1区编码的ESAT-6和CFP-10刺激PBMC中的结核特异性T细胞分泌IFN-γ与否来判定是否为结核感染，因此与卡介苗和非结核分枝杆菌无交叉免疫反应。目前，T-SPOT.TB已被诸多发达国家的临床诊疗指南推荐用于结核感染的临床诊断[8]。但在大多数的发展中国家，例如中国，T-SPOT.TB试验不能用于确诊或排除活动性结核病，但对缺少细菌学诊断依据的活动性结核病(如菌阴肺结核等)，T-SPOT.TB可在常规诊断依据的基础上，起到补充或辅助诊断的作用[20]。这是由于我国潜伏结核感染患者的比例较大，T-SPOT.TB试验虽然对于潜伏结核感染及活动性肺结核的诊断具有较高的敏感度和特异度[21-22]，但存在一定的假阴性率；加上该检查技术的敏感度和特异度差异较大，同时无法区分潜伏结核感染和活动性结核病。然而，仍然有很多研究人员建议在结核病高负担国家中使用T-SPOT.TB试验作为结核病的辅助诊断方法[23-25]。另有部分研究推荐其作为疑似结核病患者的纳入或排除检查，在结核病高负担国家中有预防控制结核病传播与流行的价值[26]。

关于T-SPOT.TB在结核病人群中的诊断国内外已有诸多研究，但用于诊断糖尿病并发肺结核患者的研究报道甚少。以往的研究认为，T-SPOT.TB试验受机体免疫状态影响较大，对免疫调节受损的人群诊断敏感度较低；糖尿病患者机体免疫功能低下，T细胞数低于正常人，免疫功能受到影响，IFN-γ的分泌量应该较免疫功能正常者减少[13]，因此T-SPOT.TB的检测效果可能会受到影响。但Stalenhoef等[27]研究证实，这部分下降的IFN-γ是体内非特异性的IFN-γ，特异性的、由ESAT-6和CFP-10所激发的IFN-γ的分泌水平并不会降低。而免疫抑制状态对于T-SPOT.TB检测结果的影响是存在的，但其影响在极其严重的患者中才比较明显[28]。本文为多中心研究，纳入了207例糖尿病并发肺结核患者和95例单纯糖尿病患者，以探讨T-SPOT.TB检测在糖尿病并发肺结核患者诊断中的应用价值。结果显示，Ⅰ组患者T-SPOT.TB检测阳性率为92.9%，明显高于Ⅲ组(48.4%)；Ⅱ组患者T-SPOT.TB检测阳性率为86.4%，明显高于Ⅲ组(48.4%)。以上研究结果表明，T-SPOT.TB检测在糖尿病并发肺结核患者的诊断中具有重要价值。Walsh等[29]的研究也发现，T-SPOT.TB检测在结核病人群中的敏感度为93%，且诊断效能不受糖尿病因素的影响。Syed等[30]认为，IFN-γ的释放水平与糖尿病状态并无相关性，甚至并发糖尿病的患者对抗原刺激的反应性要强于单纯结核病患者；IFN-γ释放试验在检测糖尿病并发肺结核患者的敏感度不低于单纯肺结核患者，分析其原因可能是糖尿病并发肺结核患者机体的细菌负担更重，可促进体内的免疫刺激加强[31]。然而在笔者的研究中，Ⅰ组患者存在7.1%(10/141)的T-SPOT.TB阴性率。有多种因素可以影响T-SPOT.TB检测的阳性率，包括并发HIV感染、免疫抑制、高龄、恶病质、营养不良、肺外结核、吸烟、MTB菌株差异等[32-33]。Kim 等[34]的研究发现，T-SPOT.TB 检测的假阳性结果还可能与既往存在结核感染相关。本次研究在分枝杆菌培阳患者中产生的T-SPOT.TB检测阴性结果，可能与部分入选患者的高龄、营养状况差、并发症较多有关。此外，Lee 等[35]研究认为，结核性脑膜炎可能是T-SPOT.TB检测假阴性的危险因素；但本研究并未对302例调查对象是否并发结核性脑膜炎的情况进行分析，只能猜测其可能是造成糖尿病并发肺结核患者培养阳性组有10例T-SPOT.TB检测阴性的原因，有待进一步验证。

本次研究结果显示， T-SPOT.TB检测在糖尿病并发肺结核患者中诊断的敏感度为90.8%，另一项关于T-SPOT.TB检测在糖尿病并发活动性肺结核患者中的研究显示，其敏感度为96.67%[36]。荟萃分析结果显示，T-SPOT.TB检测在我国整体肺结核患者中的敏感度约为88%[37]。Zhang等[38]的研究显示，T-SPOT.TB检测在我国活动性肺结核患者中诊断的敏感度为94.7%；而美国-墨西哥的一项联合研究表明，其在结核病患者中的敏感度为93%[29]。可见，T-SPOT.TB检测对糖尿病并发肺结核患者的敏感度并未下降。分析其原因，可能与T-SPOT.TB技术以对MTB特异性抗原起反应的效应性T淋巴细胞为检测目标，而非检测机体的免疫反应强度。本研究中，T-SPOT.TB检测的特异度较低(51.6%)，其在单纯糖尿病组中的阳性率为48.4%；而T-SPOT.TB检测在结核病低流行国家诊断活动性肺结核时具有较高的特异度(≥93%)[39]，在结核病高负担国家中特异度较低(≤61%)[40-41]。而在本研究中，单纯糖尿病患者T-SPOT.TB检测的阳性率为48.4%，阳性率如此之高，推测这可能是由于我国潜伏结核感染患者比例较高，而糖尿病又是结核病的易感因素，糖尿病患者中潜伏结核感染者更多。当然，这也表明了T-SPOT.TB检测在诊断上存在局限性和不足，在结核病高负担国家的临床实践中应慎重评价其检测结果。

笔者在分析影响糖尿病并发肺结核患者T-SPOT.TB检测阳性结果的相关影响因素时发现，T-SPOT.TB检测阳性结果与年龄、性别、BMI、痰菌检测结果、影像学表现、并发症情况等因素均没有相关性(P值均>0.05)。高卫卫等[42]在菌阳肺结核的研究中发现，患者的年龄、性别、基础疾病及继发性疾病(结核性胸膜炎、药物性肝损伤、低蛋白血症、白细胞减低症及并发肺外结核)均不影响患者T-SPOT.TB检测的阳性率，该结果与目前研究报道的结果相一致[43-44]。仅Leow等[45]认为T-SPOT.TB检测与年龄相关，特别是>60岁的患者，但该研究纳入的样本同其他研究相比，存在种族差异。笔者的研究提示，在糖尿病并发肺结核患者中，无论是痰菌阳性还是阴性、是否有空洞、病灶范围大小、并发症情况等均不影响T-SPOT.TB检测的结果，即使是早期轻症肺结核患者，T-SPOT.TB检测仍然可以呈现阳性结果。这一结果表明，T-SPOT.TB检测可以用于糖尿病并发肺结核患者的早期快速诊断。

本研究的不足之处：本组入选患者的年龄、BMI、卡介苗接种情况存在差异性，可能会对结果产生一定的影响。此外，在实验分组设计时没有设单纯肺结核患者组，没有设健康对照组也是本研究的缺陷之一。

综上所述，T-SPOT.TB检测诊断糖尿病并发肺结核具有较高的阳性率，同时也具有良好的敏感度和准确度，受其他因素干扰小，可以作为肺结核并发糖尿病的一种辅助诊断方法。