草鱼家系选育中的亲子鉴定研究

武 栋

（山西省鱼病防治中心 山西太原 030002）

微卫星标记，又被称为短串联重复序列或简单重复序列，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星位点通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。根据微卫星的重复类型可以把微卫星分为完全、不完全和复合型微卫星。微卫星在基因组中数目巨大，据估计，真核基因组中平均每6kb就存在一个微卫星序列[1]。毛细管电泳法是一项高效快速的分离分析技术，该方法以PCR扩增含有微卫星位点的目的DNA片段为基础，然后利用毛细管电泳法分离分析。毛细管电泳法主要是快速、微量、分辨率高、重复性好、易于定量和适合自动化检测等优点，它能保证系统的稳定性和PCR扩增的效果。因此，微卫星标记是强大的家庭跟踪工具[2]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用材料来自长江水系四大家鱼原种场人工繁殖的草鱼群体，包含该群体的所有亲本（父本14尾及母本16尾）及随机抽取的子代66尾，共96尾。

1.2 实验方法

1.2.1 样本收集及基因组DNA的提取

草鱼30尾亲本和随机子代样本66尾，剪取尾鳍，用95%乙醇浸泡，置4℃保存。本实验所用的软体动物基因组DNA提取试剂盒和提取草鱼鳍条DNA的方法均由天根生化科技有限公司提供。鳍条DNA提取后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA提取物的完整性和纯度，并存储在-20℃冰箱备用。

1.2.2 引物来源

本试验10个微卫星引物参照现已发表的文献[3]，由广州省艾基生物工程技术公司合成。

1.2.3 PCR扩增及检测

反应体系共 20 μL：1.2 μL 的基因组 DNA，0.2 μL的 10×buffer，0.8 μL 25 mmol/L 的 Mg2＋，0.2 μL 5U/μL的 Taq 酶，稀释后的上、下游引物各 0.5 μL，0.3 μL 10 umol/L 的 dNTPs，14.5 μL 双蒸水。反应程序为：94℃预热 2 min；94℃变性 30 s，适当退火温度下 30 s，72℃延伸 30 s，循环 30次；72℃延伸 5 min；12℃保存。

1.2.4 毛细管电泳的方法

PCR扩增结束后，扩增产物经2000 r/min离心1 min，室温放置2～3 min，开盖后观察，确定没有气泡后，在每个产物的液面上层覆盖10 μL矿物油以防止样品蒸发，按顺序置于Qsep100全自动核酸蛋白分析系统的样品托盘上，并设置电泳检测参数进行毛细管电泳。本实验中，检测时采用将两种PCR产物（片段大小可区分）各取10 μL混合的方法，以节省电泳及分型时间。电泳检测参数为：6 kV进样2 s，6 kV电泳5 min。电泳结束后，用Q-ANALYZER软件对电泳结果进行分析与矫正，根据扩增产物分子量的大小差异，对每个个体的微卫星基因座进行分型。

1.3 统计分析

用Cervus 3软件allele frequency analysis程序来分析他们的非亲排除率、观测和期望杂合度、Hardy Weinberg均衡、无效等位基因频率、多态信息含量、等位基因数等参数，并根据各位点的非亲排除率计算累计非亲排除率。用SimulLation of Parentage Analysis程序进行10000次模拟鉴定实验，用Parentage Analysis程序对样本进行亲权鉴定。

2 结果

2.1 挑选的微卫星引物

对试验中10对引物的PCR结果进行检测。检测结果显示全部稳定清晰，且多态性表现良好。

2.2 遗传参数分析

表1给出了10个微卫星多态位点在草鱼随机个体中的遗传参数分析结果。

由表1可知，所检测的10个微卫星标记中，有1个低度多态位点（PIC≤0.25），无中度多态位点（0.25＜PIC＜0.5），有 9个高度多态位点（PIC≥0.5）。10个微卫星标记分析检测得到了162个等位基因，其中等位基因数最少的为Cid0029，检测到4个；等位基因数最多的为Cid0004，检测到30个。每个微卫星位点的平均观测杂合度介于0.147～0.813之间，无效等位基因频率均介于0.068 6～0.292 8之间；平均期望杂合度介于0.222～0.945之间。

2.3 遗传多样性统计结果

表2所示是亲本草鱼（F0）和子代草鱼（F1）的遗传多样性变化。亲本的平均多态信息含量（PIC）为0.8067，平均期望杂合度（He）为0.831 8，平均观测杂合度（Ho）为0.6568，平均每个位点有16.2个等位基因；子代的平均多态信息含量（PIC）为0.821 7，平均期望杂合度（He）为 0.835 6，平均观测杂合度（Ho）为0.590 7，平均每个位点有18.1个等位基因。

表1 10个微卫星多态位点在草鱼随机个体中的遗传参数分析

表2 子代和亲本的多样性

2.4 非亲排除率统计结果

图1给出了10个微卫星位点的非亲排除率。

由图1可知，10个微卫星位点，当两个亲本的基因型是未知时，单个非亲排除率ne-1p在0.214～0.985之间，平均值为0.382 7；当一个亲本基因型是已知时，另一个非亲排除率ne-2p在0.12～0.912之间，平均值为0.263 3；非亲亲本组合的排除率ne-pp在0.025～0.839之间，平均值为0.140 2。由以上数据可知，低排除率的微卫星位点被证明适用于亲子鉴定。

2.5 模拟分析结果

模拟条件在亲本已知和未知情况下，测定了亲子鉴定的准确率、错配率及置信度。当已知亲本性别时，母本16个、父本14个、子代样本10 000个，真实亲本采样率为100%，相关参数为：鉴定准确率为95%，错配率为5%，置信度为95%，数据缺失率为0。当已知单独母本时，相关参数为：鉴定准确率为100%，错配率为0，置信度为96%。由模拟分析数据可知，在理想状态下，亲本的亲子鉴定可用10个微卫星位点表示，达到了较高的96%的置信度和100%的鉴定准确率。

2.6 实际鉴定结果

实际分析全部位点相关参数为：单独母本已知情况下，鉴定成功率为97%，错配率为3%，置信度为95%。该结果与模拟分析数据非常接近，说明鉴定结果具有可信性。因此，本试验以母本作为家系分类的依据可将该群体分为9个半同胞家系。

3 讨论

3.1 PCR体系的选择

目前大多都使用多重PCR的研究方法，是多重PCR引物使用荧光标记的设计和筛选指标，通过这种方法可以建立多重PCR，由于不同引物的使用，使荧光标记引物呈现不同颜色，因此只需要考虑它们之间的相容性。本试验在进行毛细管电泳时，采用类似于多重PCR技术原理，将两种PCR产物混合，以便缩短基因分型时间，提高工作效率。因此，在PCR设计基本原则的基础上只需考虑选取的各位点扩增的产物片段有一定间隔。

3.2 家系鉴定影响因素

对家系鉴定的主要影响因素有：1）在进行毛细管电泳过程中，机器运行时由于机器的封闭性，可能会导致温度上升对结果造成一定影响。针对这一问题采用风扇降温的方法，从而降低温度对实验的影响；2）在基因分型时要对原始数据进行校准，不然可能会造成遗漏。对于差距较大的数据，在其他条件不变的情况下需重新进行毛细管电泳，并重新校准机器，减少因试验误差而带来的影响。

图1 10个微卫星位点的非亲排除率

4 结论

近年来，微卫星标记技术在水产原良种选育、种质遗传鉴定以及资源增殖与评价等多方面得到了研究和应用。家系选择的本质是基因型的选择，是通过逐代富集优势基因型，以选育出纯度较高的优良性状的目的基因，正确把握近亲交配繁殖和建立品系是家系选择的关键。通过一对一交配建立起家系，生育累积隐性基因百分比的增加，纯合基因表达，增加隐性性状的概率，从而加快了一些不良基因的消除，使累积良好品质相关基因的概率大大提高，最终获得经济性状最好的品种。在家系的选择过程中，准确的系谱信息可以有效地指导亲本的选择和保留，从而缩短育种周期，提高育种效率。

在本次试验研究中，通过使用微卫星标记来获取草鱼系谱信息时，置信水平能够达到95%以上，说明本研究所选的微卫星标记可在渔业生产及科研试验中用于获取草鱼系谱信息，并可根据子代的相关性状参数，对优良品种的家系选育进行定向选择和繁育，使原良种的生物性状、生产性能更加适合渔业生产需要及市场需求，从而提高渔业生产的技术水平和水产品的市场竞争力，促进渔业经济的健康可持续发展。