对提高冷冻切片质量的探讨

龙爽等

【摘要】目的：探讨冷冻切片制作流程中容易出现的问题和对策，总结经验，旨在提高冷冻切片质量。方法：回顾性分析我院2011年11月-2017年12月接收的术中冷冻样本1071例，由两位经验丰富的病理医师阅片，为冷冻切片判读分两级，即优良片和差片。结果：统计本组冷冻切片优良率为98.7%。结论：冷冻切片质量受很多因素影响，病理技师只有通过不断地研究和总结，有利于病理医师迅速地作出正确的病理诊断。

【关键词】冷冻切片；问题；对策；提高质量

冷冻切片在病理工作中是一种重要的制片法，将新鲜组织经过急速低温冷冻、变硬后切成薄片再经染色等步骤，制成便于光镜观察的组织切片技术。它与常规石蜡制片相比，突出的优点是操作简便、迅速省时、易于光镜下观察，因此在外科手术中广泛应用Ⅲ。同时冷冻切片能良好地保存脂肪、类脂质及各种酶的活性。本文结合安岳县人民医院2011年11月-2017年12月接收的术中送检冷冻样本1071例，针对冷冻切片出现的问题进行分析，现总结如下。

1资料与方法

1.1一般资料

收集安岳县人民医院自2011年11月-2017年12月接收门诊或住院患者术中冷冻切片病理检查1071例。本组男女比例151：920，年龄9-87岁，平均（47±5）岁。所有患者均自愿选择术中快速冷冻切片病理检查，签署知情同意书，一式两份。

1.2材料

（1）OCT支持剂；

（2）洁净的玻片；

（3）1%盐酸乙醇分化液；

（4）苏木精染液、醇溶性伊红液；

（5）梯度乙醇、透明剂、中性树胶。

1.3仪器

德国徕卡CM1950恒温箱冷冻切片机，美的EG720KG4-NA型號的微波炉。

1.4方法

1.4.1预先准备

病理技师提前1小时将冷冻切片机箱体和冷冻头温度降至-22℃左右；预冷样本头；调试仪器，确认运转正常；预冷95%乙醇固定液；过滤苏木精染液并预热至37℃。

1.4.2冷冻样本接收

病理科认真核对手术室送检的新鲜样本，核对无误后，详细记录患者的基本信息，冷冻组织名称和冷冻病理编号，样本件数，接收样本时间，送检人和验收人双签名。

1.4.3取材

病理医师检查送检样本，选择2-3块具有代表性的组织块，与病理技师交接。

1.4.4包埋与切片

技师将组织块放置在样本头上，滴加少量OCT支持剂，立即将其置于冷冻切片机内速冷区域，并放上冷冻锤。待组织与冷冻锤分离，即可开始切片。将冻好组织块的样本头在切片机夹头上夹紧，以对角线作为切入口，粗修至最大切面；分别选择切片厚度分别为6微米和4微米（除脂肪组织选择15微米的切片厚度外），快速细修2-3次后，分别切出完整的切片两张，按照载玻片左侧6微米、右侧4微米的切片附贴原则，将两张厚度不同的切片附贴在同一张编好号的载玻片上。

1.4.5固定与染色

将冷冻切片立即放入95%冷乙醇中固定1min，水洗数s，按规范进行快速HE染色。

1.4.6封固与交接

冷风干燥切片，中性树胶封固，粘贴标签。再次核对无误后与病理医师交接，记录交接时间。整个制片时间共计约15

1.5判读结果

由两位经验丰富的病理医师阅片，为冷冻切片评估分两级，即优良片和差片。

优良片评估标准为：切片完整，厚度4～6μm，厚薄均匀，无褶无刀痕，冰晶小或无冰晶。染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。单件样本冰冻切片制片总时间≤15分钟。

差片评估标准为：切片不完整，过厚、有皱褶、刀痕、大颗粒冰晶。细胞变形、核浆模糊不清、红蓝对比差。组织模糊、封裱不美观。影响病理诊断。

2结果

本组冷冻切片优良率为98.7%。

3讨论

术中快速冷冻病理诊断是病理医师最具风险的急诊工作，而高质量的冷冻切片是病理诊断的重要基础，因此病理技师要提高冷冻切片的质量，除了严谨的工作态度外，还需要熟练掌握冷冻切片制作环节中的注意事项、问题和相应的处理对策脚。

（1）样本自身因素。冷冻样本要求必须新鲜，严禁沾水或液体浸泡。但是偶尔会出现人为意外情况，病理技师要准确判断样本受损程度并纠正改善组织情况。①少量液体附于样本表面，只需用吸水纸或干纱布吸掉水分即可；②大量液体如血液或囊液浸泡，尽量选择样本浸泡少的位置选取组织块，吸掉水分后，按照规范制作冷冻切片；③固定液浸泡的样本，则用蒸馏水或生理盐水清洗多次，吸干组织表面水分，放在样本头上，加OCT支持剂，稍凝结后入液氮罐内5分钟后，取出在冷冻切片机上切片。

（2）取材。病理技师要与取材医师积极沟通，取材时要特别注意：①取材台面和器械保持干燥，切忌用水冲洗样本；刀具锋利，避免人为造成组织挤压；要注意避开线结、钢钉、结石、骨或钙化等会导致切片破碎或刀痕的异物；同时要避免在有大量出血坏死的区域选材。②选取的冷冻组织块平整且大小厚薄适宜，20mm×20mm×3mm，厚度不超过4mm，太厚会延长冷冻时间；若是囊壁样组织须切成长条状，卷曲成U形并竖立包埋；若是过于碎小冷冻组织，如直径<2mm者，建议取消冷冻切片。若有包膜、微小病灶或特定切面等，病理医师必须与病理技师明确交接，详细说明；病理技师需及时沟通病理医师，充分理解医师意图，制成符合要求的冷冻切片。

（3）包埋。新鲜冷冻组织在包埋时正确应用速冷区、OCT支持剂和冷冻锤非常重要。一般先在预冷的样本头滴加少许包埋剂，因低温使包埋剂稍凝结发白，快速将组织块放上轻压，使组织处于同一水平切面，再覆盖少许支持剂。然后将样本头置于冷冻切片机速冷区，并放上冷冻锤使组织平整，并加快冷冻速度。有研究证明：急速冷冻，可以防止或减少冰晶的出现。碎小组织包埋时，建议先用OCT支持剂在样本头上做一个冷冻台，粗修成一个带平台的样本头备用。然后将碎小样本放置在平台上，覆盖OCT支持剂。这种方法可以使所有的组织都在同一个水平面上，有利于完整切片。

（4）冷冻温度的选择、冷冻速度和冷冻时间，对于冷冻切片都非常关键。大量文献显示，不同组织适宜不同温度：例如富于脂肪的纤维脂肪组织、乳腺组织、皮肤组织及脂肪肿瘤为-40～35℃，质地柔韧的组织为-18～25℃，质地偏脆软的组织为-18～20℃，碎小组织则为-15～18℃。而在基层病理科的实际工作中，一个病例取材可能有多个不同组织的样本，技师不可能为每一个样本更改冷冻温度，通常是设置为-22℃左右，因此难以制作出最佳的冷冻切片。

急速冷冻与缓慢冷冻的区别：有研究指出，急速低温冷冻组织时，细胞内液和细胞外液同时结冰，形成玻璃状态，镜下表现为细胞的形态保存良好，无收缩，无冰晶或细小冰晶，利于显微镜下观察病变。而缓慢降温导致细胞内液的水分子向细胞外游离聚集，然后凝结成冰晶，细胞发生膨胀和机械性挤压，导致细胞形态发生变化；染色过程升温时，冰融化留下空洞，显微镜下见大小不一的空洞，形状颇似核偏位的脂肪细胞或印戒样细胞，严重影响冷冻诊断的正确性。

（5）切片：一般来说，病理技师选择组织块的对角线作为切入口，同时注意“留根”，即切片时注意不要将组织全部切掉，让其稍有一点连结，然后用毛笔由上至下把组织拨平整，载玻片附贴。另外，本文作者一般制作2套冷冻切片，1套做染色，另1套则在固定液中备用，当需要重新染色时，可以节约时间。

（6）脱片：快速HE染色中，切片经历骤冷骤热和水洗作用，或载玻片有灰尘、霉菌等杂质，或切片太厚，可能出现掉片。因此制作冷冻切片时一定要用洁净的玻片，必要时可采用冷风干燥切片、防脱载玻片、或利用漂烘仪烤片等方法防止脱片。

（7）静电：有文献探讨冷冻切片附贴的静电现象，建议病理技师切片时减少毛笔刷扫切片台，或摘下橡胶手套后附贴切片，但是，由于新鲜樣本可能带有可被传播的感染源，病理技师须遵循标准预防措施，做好个人防护，因此本文作者不支持此种做法。

（8）固定：我科采用95%冷乙醇作为固定液。95%乙醇具有价格低廉、穿透力强、无污染等优点；且对比甲醇、甲醛等试剂，无毒副作用，是非常合适的固定液。预先冷却乙醇，可以减少因温差掉片的可能性。

（9）染色与封固中出现的问题：因病理技师操作不当或时间不足，可能出现染色不佳、脱水不佳、封固不佳等问题。有相关文献详细探讨过这些问题的原因分析和应对措施，本文作者就不赘述了。

总之，冷冻切片质量受很多因素影响，有一定的局限性，病理技师只有通过不断地研究和总结，才能制作出高质量的冷冻切片，有利于病理医师迅速地作出正确的病理诊断，满足临床需求，节省患者就医时间。