四种植物水提液对胡萝卜软腐病菌的抑制效果研究

贺理，陈洁，陈曦，张睿，陈存

（成都师范学院 化学与生命科学学院，四川成都 611130）

我国是一个农业大国，在农业生产过程中，农作物经常会遭受各种病虫害，其中植物病原细菌引起的植物病害尤为明显。胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）是多种植物的病原细菌，它主要侵害植物地下部肉质根，造成植物的软腐与湿腐，如果侵染维管束组织，会阻碍水分输送而导致地上叶片出现萎蔫等症状[1]，对我国农业生产造成巨大危害，严重影响农业经济的发展。近年来，人们对于绿色安全越来越关注，逐渐把目光投向生物抑菌剂，其中植物源抑菌剂由于其提取工艺简单、效果显著、无环境污染而备受人们青睐[2]，因此，对新型植物源性质抑菌抗菌物质的研究也愈加重视。大蒜（Allium sativum）、柑橘（Citrus reticulata）、洋葱（Allium cepa）、柚子[Citrus maxima (Burm)]等植物具有其特有的抗菌特效，在研发植物抗菌剂方面具有广阔的应用前景[3-8]。

本研究采用4种天然植物水提取液对胡萝卜软腐欧文氏菌进行抑菌试验，筛选具有较高生物活性的植物，为其抑制植物病原细菌以及控制植物病害的发生等提供理论依据。该方面的研究成果对发展生态农业、促进绿色食品工业的发展、构建人与自然环境的和谐发展等方面具有十分深远的意义[9]。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌种

胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora，BNCC138474）菌种冻干粉，购于北京北纳创联生物技术研究院。

1.1.2 供试植物样品

植物样品供试部位及产地详见表1。

表1 供试植物样品表

1.1.3 主要仪器及试剂

仪器设备：不锈钢整体式游标卡（DL92150，Deli）；高效液相色谱仪（CBM20A, Shimadzu）。

试验药品：营养肉汤培养基（NB）、琼脂粉、乙腈（色谱纯）、去离子水等。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化及菌悬液的制备

胡萝卜软腐欧文氏菌菌种冻干粉加入无菌水混匀，接种到营养肉汤平板培养基上，待其生长成熟，挑取单菌落转接到营养肉汤液体培养基中，振荡培养至菌液OD值约为0.6时停止培养，放入4 ℃冰箱备用。

1.2.2 天然植物水提液的制备

大蒜鳞茎剥皮、柑橘皮、洋葱鳞叶剥皮、柚子皮切碎研磨后各称取20 g，按1∶3比例加入去离子水，室温下密封浸提4 h，纱布过滤，滤液在离心机10 000 r/min下离心20 min，取上清液通过0.22 μm无菌滤膜，得到4种植物水提液，放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 天然植物水提液抑菌试验

将4个灭菌后的牛津杯依次放置在配制好的NB固体培养基上，分别加入100 μL 4种植物水提液（大蒜鳞茎水提液稀释2倍），置于28 ℃恒温培养箱中培养，重复3个平板。24 h后，测量抑菌圈直径。

1.2.4 大蒜鳞茎水提液的液相色谱分析

对大蒜鳞茎水提液中的有效抑菌成分进行高效液相色谱（HPLC）分析，分析条件如下，色谱柱：C18柱（250 mm×4.5 mm），流动相：乙腈/水=30/70（V/V），Diode Array检测器，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，进样量100 μL，检测波长210 nm。

2 结果与分析

2.1 四种天然植物水提液对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑菌效果

试验分别测定了4种植物水提液对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑菌效果，用游标卡尺测量4种植物水提液抑菌圈直径，结果见表2。可以看出，4种植物水提液对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑制效果不同，大蒜鳞茎、柑橘皮、洋葱鳞叶、柚子皮水提液形成的抑菌圈直径分别为24.73 mm、5.03 mm、17.8 mm、4.72 mm，说明4种植物水提液对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑菌作用强度依次为大蒜鳞茎水提液＞洋葱鳞叶水提液＞橘皮＞柚子皮水提液。

2.2 HPLC对大蒜鳞茎水提液有效抑菌成分的分析

利用高效液相色谱对大蒜鳞茎水提液的有效抑菌成分进行分析，得到液相色谱分析结果如图1和表3。可以看出，大蒜鳞茎水提液中可能的有效抑菌成分有7种，对胡萝卜软腐欧文氏菌明显的抑菌效果可能是这7种成分中一种或几种共同作用的结果。

图1 大蒜鳞茎水提液液相色谱分析图谱

表2 四种植物水提液对胡萝卜软腐欧文氏菌形成的抑菌圈直径

表3 大蒜鳞茎水提液液相色谱分析图谱数据记录

3 讨论

试验中，大蒜鳞茎水提液在稀释两倍后进行抑菌试验，发现其抑菌效果依然明显强于其他3种植物水提液，表明大蒜具有超强杀菌能力。洋葱鳞叶水提液对胡萝卜软腐欧文氏菌也有一定的抑菌效果，但抑菌效果不如大蒜，而柑橘皮和柚子皮水提液没有明显的抑菌效果。一些研究报道中，大多用有机物提取橘皮和柚子皮中的抑菌活性成分。李凌绪等发现，橘皮石油醚提取物的抑菌效果最好，水提取物的抑菌效果最差，说明橘皮中主要抑菌活性成分可能是低极性物质[10]。此外，唐俊妮等证实，不同洋葱品种的抑菌效果也会有差异，紫皮洋葱抑菌效果要稍优于白皮洋葱[11]。因此，同种植物的不同品种的抑菌效果也可能不同。康美玲的研究认为洋葱原汁的抑菌效果要强于洋葱提取物的抑菌效果[12]。由此可以思考，是否大蒜原汁、洋葱原汁、橘皮精油和柚子皮精油的抑菌效果更好，尚需进一步研究。

对大蒜鳞茎水提液进行高效液相色谱分析的结果表明，大蒜鳞茎水提液中含有7种可能的有效抑菌成分，具体的成分需要做气相色谱-质谱联用（GC-MS）才能得到进一步分析，具体是哪一种或哪几种成分能够真正抑菌，还需将各成分收集起来进一步进行抑菌试验，才能分析得出结论。

本试验中发现大蒜鳞茎水提液和洋葱鳞叶水提液对胡萝卜软腐欧文氏菌有抑菌作用，且大蒜鳞茎水提液效果明显。这为防治胡萝卜软腐欧文氏菌对农作物的危害提供了初步理论依据，期望能够在这一方面继续挖掘其价值，推动植物源杀菌剂应用开发的研究进程，促进生态农业和绿色食品工业的发展，创造人与自然和谐共存的美好未来。