普鲁卡因抑制脂多糖诱导的结肠癌细胞肿瘤侵袭性的作用机制

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(1.陕西省肿瘤医院麻醉科，陕西 西安 710061；2.陕西省肿瘤医院重症医学科，陕西 西安 710061)

恶性肿瘤具有细胞生长不受控制的特性，是严重致命的疾病之一[1]。消化道系统恶性肿瘤中最普遍的结肠癌是仅次于肺癌和乳腺癌的第三大癌症，是癌症死亡的第二常见原因[2-4]。与疾病有关的基因，与许多癌症类型有关[5]。结肠癌的发病机制和相关分子是目前的研究热点。化学治疗被认为是控制多种恶性肿瘤有效治疗方法之一。尽管由于其严重的细胞毒性且无法仅作用于恶性肿瘤细胞，标准化疗计划通常只能一定程度上延长生存时间[6-7]。目前主要的问题是化疗药物的靶向性不足，导致作用靶标偏离目标细胞而造成过多的副作用[8]。之前已有相关文献集中讨论了联合使用麻醉药物治疗恶性肿瘤[9]。普鲁卡因是常用的局部麻醉药品，也是常用的化疗药物之一。其表现出一种表观遗传的行动模式，去甲基化剂为DNA高甲基化CpG岛，因此成为治疗不同类型癌症的选择之一[10]。本研究的主要目的是探讨普鲁卡因(作为DNMT抑制剂药物的代表)对结肠癌细胞生物学行为的影响情况，从而明确普鲁卡因在结肠癌细胞中作用机制。

1 材料与方法

1.1 组织样本和实验器材

脂质体Lipofectamine 2000购自上海吉凯基因，Trizol购自美国Ambion公司。PCR试剂盒购自美国Kapa公司。荧光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司。荧光素酶报告载体由Promega公司合成。Transwell小室购自美国Millipore公司(Millipore，Billerica，MA)，Matrigel购自Bio-Rad (Bio-Rad，Madrid，Spain)。

1.2 细胞株和培养

人类结肠癌细胞系(sw480)获自中国科学院细胞库(中国上海)。所有细胞在含有10%胎牛血清和100 u/mL青霉素或100 mg/mL链霉素的Dulbecco’s改良的Eagle培养基中培养，培养条件：37 ℃含5%CO2的恒温孵箱中。

1.3 细胞活性测定

使用不同浓度的普鲁卡因处理结肠癌细胞，在24 h后以每孔5 000个细胞接种于96孔板(每孔5 000个细胞)中。在接种细胞24,48和72 h后，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)测量细胞增殖。使用微孔板分光光度计在450 nm处测定吸光度。实验重复3次。

1.4 蛋白质印迹

使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，并将其转移到硝酸纤维素膜。使用5%脱脂牛奶充分封闭膜，并与LPS抗体(浓度1∶1 000)，内参GAPDH(浓度1∶2 000)，4 ℃，孵育过夜。次日，TBST充分冲洗过后，使用二抗辣根酶标记物(浓度1∶5 000)孵育2 h，TBST充分冲洗过后，使用增强的化学发光试剂ECL显影液检测目标蛋白的表达水平。

1.5 细胞迁移能力检测

使用伤口愈合测定评估细胞迁移。将转染的细胞在6孔板(每孔5×104个细胞)中培养。在90%～95%汇合时，使用无菌塑料微量移液枪头刮擦单层细胞，然后将细胞在标准条件下培养24 h。洗涤几次后，观察伤口的恢复并使用X71倒置显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)拍照。

1.6 细胞侵袭能力检测

使用Transwell侵袭测定以确定细胞侵袭。将1×105个转染的sw480细胞接种到具有游离血清培养基的上室中。含有10%FBS的培养基作为趋化剂添加到下部室中，将细胞在37 ℃和5%CO2下侵入48 h。然后将侵入过滤器下表面的细胞在70%乙醇中固定30 min，并用0.1%结晶紫染色10 min。在倒置显微镜下随机选择的5个视野中计数迁移到下侧的细胞数。实验重复3次。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度的普鲁卡因对结肠癌细胞的影响

通过CCK-8细胞活性实验检测不同浓度的普鲁卡因对结肠癌细胞细胞活性的影响情况，实验结果显示：质量浓度为0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mg/mL的普鲁卡因处理结肠癌细胞，细胞活性分别为(0.82±0.12)，(2.21±0.35)，(2.98±0.41)，(4.12±0.81)，(1.72±0.81)。说明质量浓度为0.08 mg/mL的普鲁卡因对结肠癌细胞的活性影响情况最明显，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 不同浓度的普鲁卡因对结肠癌细胞细胞活性的影响

2.2 普鲁卡因对脂多糖表达活性的影响

Western blotting检测不同浓度的普鲁卡因对脂多糖结合蛋白表达情况的影响。实验结果显示：质量浓度为0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mg/mL的普鲁卡因处理结肠癌细胞后，各组脂多糖结合蛋白相对表达量分别为(35.62±4.32)，(31.29±5.32)，(19.25±3.26)，(8.62±2.21)，(31.95±3.35)。表明合适浓度的普鲁卡因可以抑制脂多糖结合蛋白的活性，其中质量浓度为0.08 mg/mL的普鲁卡因对脂多糖结合蛋白的表达水平抑制最明显，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2Westernblotting检测普鲁卡因对脂多糖结合蛋白表达的影响

2.3 普鲁卡因对结肠癌细胞迁移能力的影响

为了进一步评估普鲁卡因对结肠癌细胞体外转移的影响，在用0.08 mg/mL的普鲁卡因处理结肠癌sw480细胞后测定细胞迁移能力。划痕愈合测定显示普鲁卡因可以直接抑制结肠癌细胞的运动能力，相比对照组细胞，迁移距离比例相对减小，且随着时间进展差异明显加大，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3划痕愈合实验检测普鲁卡因对结肠癌细胞迁移能力的影响

2.4 普鲁卡因对结肠癌细胞侵袭能力的影响

使用Transwell侵袭实验检测普鲁卡因对结肠癌细胞侵袭能力的影响，实验结果显示：相比对照组细胞，24 h后的侵袭细胞数目相对减少[(28.35±3.36)vs.(19.21±2.62)]，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。上述结果表明普鲁卡因可以直接抑制结肠癌细胞的侵袭行为。

图4Transwell侵袭实验检测普鲁卡因对结肠癌细胞侵袭能力的影响

3 讨论

鉴定临床治疗对恶性细胞的影响最直接的方法之一是评估细胞活力的表达[11]，通过对比不同组细胞活力的变化判断药物的作用效果。细胞数量的减少可归因于外源性凋亡途径的激活，通过该外源性凋亡途径，普鲁卡因与苯基丁酸钠联合使一些凋亡相关基因去甲基化，继而激活细胞凋亡，导致细胞活性降低[12-13]。有研究已经表明化疗药物/药物组合在减少恶性细胞活性方面具有显著功效[14-15]。同时有研究指出苯二甲酸丁二醇酯与普鲁卡因联用时有拮抗作用，其中前者可以抑制普鲁卡因起作用[16]。但当普鲁卡因与厄洛替尼或卡铂结合时，细胞活性显著降低。厄洛替尼和卡铂与普鲁卡因相比也具有不同的作用方式[17-18]。

本研究显示，浓度为0.08 mg/mL的普鲁卡因对结肠癌细胞的活性影响情况最明显，同时该浓度的普鲁卡因对脂多糖LPS的影响作用最明显。进一步探讨普鲁卡因对结肠癌细胞生物学行为的影响，结果表明使用0.08 mg/mL 的普鲁卡因可在一定程度上抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭行为，表明适宜浓度的普鲁卡因可能在一定程度上抑制肿瘤细胞的生物活性，但是针对其可能的调控机制及蛋白表达目前尚无相关研究指出。

有研究表明全身炎症和术后感染在一定程度上可以导致恶性肿瘤的复发[19]。对术后革兰阴性细菌感染促进癌症复发的机制了解甚少。尽管脂多糖诱导的系统性炎症可以增加肿瘤细胞向肝窦的募集和体内肝转移，但是有关脂多糖对体内癌细胞的转移潜能直接影响的文献较为有限[20]。尽管脂多糖可能会改变癌细胞的增殖和凋亡行为，并且可能参与癌细胞的转移过程，但其在结肠癌细胞中的表达作用目前不甚清楚。之前有学者证实了脂多糖可以诱导的TLR4信号传导，促进人肝癌细胞在体外对内皮细胞和各种ECM底物的黏附能力[21]。事实上，有研究表明，脂多糖可能诱导免疫抑制细胞因子和促血管生成趋化因子的分泌[22]。本实验中，通过检测合适浓度普鲁卡因对脂多糖结合蛋白的表达水平的调控，推测普鲁卡因可以影响脂多糖结合蛋白的表达进一步干扰结肠癌细胞的迁移和侵袭行为，在sw480细胞中的实验可以验证这一点。之前有研究指出，一方面，普鲁卡因可以通过与肝窦内的不同的基质组分直接相互作用来介导细胞黏附；另一方面，普鲁卡因可以直接与内皮细胞上的蛋白受体结合配偶体结合发挥调控作用[23]。所以，通过本研究的结果推测普鲁卡因可能通过影响脂多糖结合蛋白的表达调控结肠癌细胞的迁移和侵袭。

当然，本研究存在一定程度的不足，普鲁卡因作为一种化疗辅助药物，可以进一步探讨与其他化疗药物(如卡铂、厄洛替尼、顺铂等)的联合作用，增强普鲁卡因在临床治疗中的应用方式，同时还需要完善动物体内实验，进一步证明普鲁卡因对实体肿瘤的作用效果。

综上所述，本研究结果表明普鲁卡因可作为化疗辅助药物，为探索结肠癌诊疗的分子机制和新的潜在治疗策略提供相应理论帮助，为结肠癌的临床治疗方式提供有效的支持。