慢性阻塞性肺疾病小鼠肺组织中Th17/Treg细胞的变化及意义

张婧 张兰英 欧阳瑶（通讯作者）

（遵义医学院附属医院 贵州 遵义 563000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的可以预防和治疗的呼吸系统疾病，其发病率和死亡率在全球范围内呈逐年上升趋势[1]。COPD的发病与长期吸烟等有害因素引起的异常炎症反应密切相关，但其具体机制至今尚不明了。最新研究表明，CD4+T淋巴细胞介导的免疫炎症可能与COPD的发病有关[2,3]。辅助性T细胞 17（Thelpercells 17，Th17）和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）是重要的CD4+T细胞亚群。Th17细胞可以促进炎症反应的发生[4]，白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）是它分泌的一种关键性活化因子，可以促使多种细胞释放炎性介质，从而介导炎症反应。而Treg细胞具有免疫抑制作用，不仅能抑制炎性介质的产生，还能抑制炎性细胞的分化、增殖，叉头状转录因子3（forkhead box protein 3，Foxp3）可以控制它的生长、分化和功能，是鉴定Treg最可靠的检测指标。在炎症性疾病发病中两种细胞在功能上相互拮抗。正常状态下，Treg细胞和Th17细胞之间的相对平衡在维持免疫稳态中有决定性意义。若这种平衡被破坏，就会导致免疫炎症性疾病发病[5,6]。

因此，本研究拟通过烟熏法建立COPD小鼠模型，流式细胞术检测小鼠肺组织中Th17细胞和Treg细胞的变化，以期为COPD的发病机制提供新的理论依据。

1.材料

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠26只，雌雄不限，6～8周龄，体重20g～25g，由第三军医大学实验中心提供，许可证号为SCXK（渝）2012-0005。

1.2 主要材料

黄果树牌香烟（焦油量：11mg；烟气烟碱量：0.9mg；烟气一氧化碳量：13mg）（贵州中国工业有限责任公司）。Anti-Mouse CD4 FITC、Rat IgG2a K Isotype Control FITC、Anti-Mouse CD25 PE-Cyanine5、Rat IgG1 K Isotype control PE-Cyanine5、Anti-Mouse/Rat Foxp3 APC Rat IgG2a K Isotype control APC、Anti-Mouse/Rat IL-17A PE、Rat IgG2a K Isotype control PE、Flow Cytometry Staining buffer、Fixation/Permeabilization Concentrate Fixation/Permeabilization Diluent（上述试剂均来自eBioscience公司）。

2.方法

2.1 动物模型的制备和分组

将26只C57BL/6小鼠随机分为对照组（n=10）和COPD模型组（n=16）。将16只模型组小鼠置于自制有机玻璃烟熏箱内（大小为90cm×40cm×30cm，箱盖上有9个1.5cm×1.5cm大小的通气孔），每日被动吸烟4次，6支烟/次，1h/次，共28天。10只对照组小鼠则暴露于空气中，正常饲养。

2.2 肺组织病理学检测

取小鼠右肺下叶用4% 的多聚甲醛固定 24 h ，石蜡包埋切片，组织切片进行 HE 染色。使用软件IPWin32采集HE染色切片图像，随机采集多个完整气道图像，最后由我院病理科医师分析图片。

2.3 制备单细胞悬液

在RPMI 1640培养基中加入Ⅳ型胶原酶粉，配制Ⅳ型胶原酶。将肺组织剪碎，放入盛胶原酶的离心管中，置于水浴箱内（37℃），直至肺组织消化，收集消化液，过滤至第二个试管，离心，弃上清；加入2ml PBS，用吸管吹打，离心，弃上清；加入5ml红细胞裂解液，裂解直至溶液透明，离心，弃上清；再用PBS漂洗，离心，弃上清；最后加入1ml含1%FBS的PBS及200ul 1%多聚甲醛，振荡混匀，即为所需悬液。

2.4 流式细胞术检测CD4+IL-17和CD4+CD25+ Foxp3的变化

CD4+IL-17检测：在250ul单细胞悬液中加入250ul RPMI1640培养基，再加入2ul 250×PMA/Ionomycin及2ul 250×Monensin/BFA，置于5%CO2孵箱内培养5h；测定管加入4ul Anti-Mouse CD4 FITC，对照管加入4ul Rat IgG2a K Isotype Control FITC；各加入200ul培养好的单细胞悬液，孵育、固定、漂洗、溶血、破膜，再于测定管中加入2ulAnti-Mouse/Rat IL-17A PE，对照管中加入2ulRat IgG2a K IsotypecontrolPE，然后孵育、漂洗，上机检测。

CD4+CD25+Foxp3检测：测定管加入4ul Anti-Mouse CD4 FITC、2ul Anti-Mouse CD25 PE-Cyanine 5，对照管加入4ul Rat IgG2a K Isotype Control FITC、2ul Rat IgG1 K Isotype control PE-Cyanine 5；各加入200ul单细胞悬液，孵育、漂洗，漩涡震荡细胞沉淀，各管中加入1ml现配制的固定/破膜工作液，再孵育、漂洗；测定管中加入5ul Anti-Mouse Foxp3 APC，对照管中加入5ul Rat IgG2a K Isotype control APC，最后孵育、漂洗，上机检测。

2.5 统计学处理

3.结果

3.1 两组小鼠的一般情况

对照组：小鼠全身皮毛光泽，精神活动正常自如，呼吸平稳，食欲正常，体重增加，体型饱满，实验期间小鼠无死亡。

COPD模型组：小鼠全身皮毛干枯、灰暗，精神倦怠，双眼微闭，活动减少，呼吸急促，食欲减退，体重下降，且上述症状呈逐渐加重趋势，烟熏期间小鼠无死亡。

3.2 光镜观察小鼠肺组织病理特征

对照组：肺泡结构清晰，肺泡壁完整且连续，肺泡间隔可见少量炎症细胞浸润（见图1A）。

COPD模型组：肺泡结构破坏，多数肺泡相互融合形成较大的肺泡腔，肺泡间隔有明显的炎症细胞浸润（见图1B）。

图1 实验第28天两组小鼠肺组织HE染色（×200倍）

3.3 小鼠肺组织中Th17和Treg的百分比含量

将收集的肺组织标本予以处理后，采用流式细胞术检测Th17和Treg的变化，结果显示：与对照组（0.66±0.28）相比，Th17的百分比含量在模型组小鼠肺组织中（2.41±0.33）增高，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。模型组小鼠肺组织中Treg的百分比含量（0.37±0.11）较对照组（0.93±0.30）降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 两组小鼠肺组织中Th17和Treg的百分比含量（±s）

表1 两组小鼠肺组织中Th17和Treg的百分比含量（±s）

注：与对照组（Th17）相比，*P＜0.05；与对照组（Treg）相比，ΔP＜0.05。

组别（例数） Th17（%） Treg（%）对照组（n=10） 0.66±0.28 0.93±0.30 CODP 模型组（n=16） 2.41±0.33* 0.37±0.11Δ

3.4 小鼠肺组织中Th17/Treg的比值

模型组小鼠肺组织中Th17/Treg的比值（7.26±2.97）高于对照组（0.50±0.24），差异有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

表2 两组小鼠肺组织中Th17/Treg的比值（±s）

表2 两组小鼠肺组织中Th17/Treg的比值（±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别（例数） Th17/Treg对照组（n=10） 0.50±0.24 COPD模型组（n=16） 7.26±2.97*

4.讨论

COPD是一个严重危害公众健康的全球性问题。吸烟被公认为COPD发病最关键的诱发因素，然而，COPD患者戒烟后肺组织及气道炎症仍持续存在，这表明COPD的发病机制可能与自身免疫炎症有关。香烟烟雾可能导致T细胞启动一个“异常”的免疫应答，导致机体免疫失调，使COPD患者易患呼吸道感染[7]。

本研究采用烟熏法建立COPD小鼠模型，烟熏第28天取小鼠肺组织行HE染色，观察肺组织病理形态变化，结果显示：与健康对照组相比，COPD模型组小鼠有明显的肺部炎症及肺气肿改变，符合人类COPD的特征性病理变化，提示COPD小鼠模型建立成功。

迄今为止，在COPD的发病机制中香烟烟雾对初始T细胞的作用尚不明确。因此，本实验观察香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型肺组织中Th17细胞和Treg细胞的变化，结果表明COPD模型组小鼠肺组织中Th17的百分比含量高于对照组，而Treg的百分比含量则低于对照组。香烟烟雾是Th17细胞的一种有效佐剂，它能够诱导IL-1β、IL-6等效应性细胞因子的产生[8]，这一类细胞因子又能够抑制Foxp3的表达和Treg细胞的分化，并且使Treg细胞向Th17细胞转化，这可能是COPD中存在Th17/Treg失衡的原因之一。有研究者发现在慢性过敏性气道炎症中Th17细胞可以抑制Treg细胞介导的免疫应答[9]。也有研究发现在肺炎支原体抗原诱导的炎症模型中Treg细胞又可通过减少IL-17的产生抑制Th17细胞介导的免疫激活[10]。Th17/Treg 失衡与COPD患者的肺功能恶化和疾病进展有关[11]。上述结果均提示Th17细胞和Treg细胞介导的免疫失衡在COPD的发病过程中可能具有重要的作用。

为了评估COPD模型组小鼠体内Th17/Treg失衡的程度，本研究计算每一个实验标本中Th17与Treg的比值，结果显示与对照组相比，COPD模型组小鼠肺组织中Th17与Treg的比值增高，提示香烟烟雾打破Th17/Treg的相对平衡，偏向于Th17细胞介导的免疫炎症反应，同时抑制Treg细胞的免疫调节作用，从而使COPD的炎症反应持续存在且不断放大，因此，有效调节Th17/Treg失衡可能是延缓COPD病情进展的关键关节。

总之，本研究结果提示香烟烟雾可能导致Th17细胞和Treg细胞介导的免疫失衡，提示肺组织中Th17/Treg失衡可能参与COPD的发病机制。为了提供COPD患者更好的临床治疗方案，我们仍需进一步研究如何调节其免疫失衡。