黑曲霉发酵液中5-HMF含量的测定

陈家祥 徐策 张素 熊德欣 代园凤 郑泽轩 陈雪 李祝

摘 要：本实验建立了测定黑曲霉（Aspergillus niger）发酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。对5-HMF标准溶液进行全波长扫描，确定最大吸收波长为测定波长，并绘制5-HMF浓度与吸光度之间的标准曲线;用50%乙醇将原发酵液稀释50倍，在测定波长处测定吸光度，对应标准曲线，计算发酵液中的5-HMF含量。结果表明，5-HMF最大吸收波长为283 nm，R2为0.9995，线性关系良好，发酵液5-HMF平均浓度为171.743 μg/mL，平均回收率105.86%，精密度RSD为0.13%，重复性RSD为0.40%，仪器检出限为0.007 μg/mL。该方法简便，快速，成本低，准确度较高，为今后研究黑曲霉中5-HMF含量提供了一个可借鉴的方法。

关键词：黑曲霉;5-HMF;紫外分光光度法

中图分类号：Q939.96

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）06-0087-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.015

5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF），又名5-羟甲基-2-糠醛[1]，由葡萄糖或果糖脱水生成[2]，其分子中含有一个呋喃环，醛基和羟基，性质非常活泼，可通过氧化、氢化和缩合等反应制备多种衍生物，是一种良好的化学平台物质。5-羟甲基糠醛可用于生产燃料和反应中间体[3]，同时还有抗癌细胞增值活性，降血糖等药理作用[4-5]，近年我国5-羟甲基糠醛产品行业销售收入呈指数增长[6]，应用前景广泛。

黑曲霉为曲霉属的一个常见种[7]，可生产柠檬酸[8]，糖化酶[9]等，也可作为宿主进行外源表达，广泛用于食品原料、药物、酶的生产[10-11]，是发酵工业中的重要菌种。于能江[12]从头孢酶属的发酵物中分离出5-HMF，陈楠等人[13]从蜜环菌中提取5-HMF，均表明微生物发酵液中可产5-HMF。黑曲霉在工业生产中应用广泛，利用黑曲霉发酵生产5-HMF可弥补化学法步骤复杂繁琐的缺点。在对黑曲霉中5-HMF高产培养体系的建立中对发酵液内的5-HMF含量测定是必不可少的步骤。

目前测定5-HMF的方法主要有HPLC法[14-16]、紫外分光光度法[17-19]、衍生化分光光度法[20]等。HPLC法样本处理及测定过程繁琐复杂且成本较高，不适用于长期而频繁的测定;衍生化分光光度法需将5-HMF生成衍生化合物后间接测量，步骤较繁琐，紫外分光光度法简单快捷，在5-HMF的测定中应用较多。如冯红伟等人[21]利用紫外分光光度法测定糖蜜中的5-HMF，刘月新[22]利用紫外分光光度法测定四物汤传统汤剂中的5-HMF。本实验将利用紫外分光光度法对黑曲霉发酵液中5-HMF含量进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger）xj：中国典型培养物保藏中心保存，CCTCC No：M206021。

1.1.2 试剂

5-HMF（≥99.0%）：广东翁江化学试剂有限公司;无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司;葡萄糖（分析纯）：天津市优谱化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备

BIOMATE 3S紫外分光光度計：赛默飞世尔科技有限公司;UV-8000紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司;华普达THZ-82恒温振荡器：常州华普达有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 5-HMF标准品全波长扫描与标准曲线绘制

精确吸取2.5 μL 5-HMF标准品，利用50%乙醇配制成31.075 μg/mL的储备液。精确吸取10 mL母液，加入40 mL 50%乙醇，配制浓度为6.215 μg/mL的标准液。

将标准液于UV-8000紫外可见分光光度计进行全波长扫描，取最大吸收峰值对应波长作为测定波长。

将标准液用50%乙醇梯度稀释，得0、1.243 μg/mL、2.486 μg/mL、3.729 μg/mL、4.972 μg/mL、6.215 μg/mL的6份稀释液。6份样品以50%乙醇为参比，在测定波长进行吸光度测定，并绘制标准曲线。

1.2.2 黑曲霉发酵液中5-HMF浓度的测定

将黑曲霉接种至PDB培养基，于26℃，150 r/min振荡频率下培养5 d，过滤掉发酵液中的菌丝球及孢子，于发酵液中加入等体积的无水乙醇，10000 r/min离心10 min沉淀絮状变性蛋白，吸取上清液，继续加入50%乙醇，得到原发酵液50倍稀释度的稀释液。

分别取稀释液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL加入5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL的50%乙醇，得到5个梯度稀释样品，以50%乙醇为参比，于283 nm下测定吸光度，根据标准曲线计算发酵液中的5-HMF平均浓度。

1.2.3 精密度测定

取同一份稀释液8份，以同样方法直接测定吸光度，计算相对标准偏差。

1.2.4 回收率测定

配置与发酵液5-HMF浓度相近的5-HMF标准溶液，与发酵液在相同稀释度下等体积混合后测定，计算回收率。

1.2.5 重复性实验

对同一批发酵液以相同方法平行处理，分析重复性。

1.2.6 仪器检出限测定

配制浓度为0.213 μg/mL、0.426 μg/mL、0.533 μg/mL、0.639 μg/mL的5-HMF标准溶液，利用BIOMATE 3S紫外分光光度计测定吸光度，绘制低浓度下的标准曲线，并测定20组参比的吸光度，计算仪器检出限。

2 结果与分析

2.1 全波长扫描

标准液于190～1100 nm进行全波长扫描，发现283 nm处有最大吸收峰（200～400 nm部分扫描结果），故采用283 nm作测定波长。

2.2 5-HMF标准品浓度与吸光度回归曲线

5-HMF标准品溶解于50%乙醇中，其通过计算得到的浓度与所对应的吸光度结果见表1，线性回归曲线，R2为0.9995，线性关系良好，回归方程为y = 0.1225x + 0.005。

2.3 发酵液5-HMF浓度测定

对稀释液梯度稀释后的6份样品测定，利用标准曲线求出浓度（见表2），再分别根据总稀释度求出原发酵液5-HMF浓度，为165.714 μg/mL、173.333 μg/mL、172.143 μg/mL、173.714 μg/mL、173.810 μg/mL，平均值为171.743 μg/mL。

2.4 精密度测定

取稀释液8份，直接进行紫外分光测定（见表3），RSD为0.13%，重现性良好。

2.5 回收率测定

配制186.450 μg/mL的5-HMF标准溶液，与原发酵液各稀释50倍后等体积混合并测定（结果见表4），平均回收率为105.86%，RSD为1.03%，回收率较好，可以较准确反映发酵液中5-HMF实际含量。

2.6 重复性实验

取同一批发酵液8份，以同样方法测定其中5-HMF含量（见表5），RSD为0.40%，重复性良好。

2.7 仪器检出限

配制0.746 μg/mL的低浓度5-HMF标准溶液，进行梯度稀释，绘制标准曲线，计算其斜率，低浓度时灵敏度0.1397。以20组50%乙醇进行空白测定，得空白均值为0.009，空白值标准偏差为0.03%，根据IUPAC标准[23]，k取3用于检出限计算，得最小分析信号为0.010，BIOMATE 3S紫外分光光度计测定黑曲霉发酵液中5-HMF浓度检出限为0.007 μg/mL。

3 结论与讨论

本實验建立了测定黑曲霉发酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。5-HMF标准品全波长扫描得283 nm处有最大吸收峰，故以283 nm作为测定波长;标准曲线为y=0.1225x+0.005，线性关系良好，用此法测定黑曲霉xj发酵液中的5-HMF平均浓度为171.743 μg/mL，与HPLC测定结果0.1257 mg/g相近[24]，平均回收率为105.86%，能较准确地反应5-HMF实际含量，方法重现性良好。仪器检出限为0.007 μg/mL，可以精准测定。此法操作简便快速，成本低，准确度较高，但由于比色法会受到一定的干扰，测定结果不能视为5-HMF绝对含量，可为研究黑曲霉中5-HMF含量提供一个可借鉴的方法。

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